依达拉奉对局灶性脑缺血大鼠脑组织基质金属蛋白酶9(MMP-9)表达的影响

李 淞,张逊娟,贾小影,姜 波

(1.吉林省人民医院神经内科,吉林长春130021;2.长春航天医院)

脑缺血再灌注损伤是一个复杂的病理过程,缺血后脑组织再灌注可以导致血脑屏障破坏,而出现明显的脑水肿和缺血性梗死。一些研究表明,乳腺癌、胃癌、膀胱癌患者等的MMPs表达与其预后较差关系密切[1],其中MMP-2与MMP-9可能作为判断肺癌患者预后的有用标记物[2]。但是在最近的缺血性脑血管病研究中发现,MMP-9在心脑血管疾病中起重要的作用,它的激活和脑血管关键蛋白成分的降解与出血和水肿的发展有密切关系。依达拉奉是一种自由基清除剂和抗氧化剂,涉及的机制很多,体外及动物实验已证实本药可以清除自由基抑制脂质过氧化作用和血管内皮细胞损伤,从而减轻脑缺血和脑缺血引起的脑水肿及组织损伤[3-4],本实验通过大脑中动脉线栓法建立大鼠局灶性脑缺血损伤模型(middle cerebral artery occlusion MCAO),探讨了MMP-9表达和与脑含水量变化的关系,以及依达拉奉对缺血再灌注大鼠脑水肿的影响,及其对依达拉奉对脑缺血损伤的保护作用机制。

1 材料和方法

1.1 动物及分组

健康成年雄性大鼠,体重(240±20 g)J,由吉林大学医学院基础医学院动物实验中心提供。将大鼠随机分为3组:假手术组(A组,10只),生理盐水组(B组,大脑中动脉阻断后3 h 6 h 12 h 24 h 48 h 72 h 96 h每个时点,各10只),依达拉奉处理组(C组,同B组)。

1.2 大鼠局灶脑缺血再灌注模型的制作及标本制备

采用改良的longa等[5]线栓大鼠局灶性脑缺血模型。将各组大鼠麻醉后行右侧大脑中动脉栓塞(MCAO)。线栓直径约为0.26 mm,插入深度约为(18±0.5)mm,此时线栓位于大脑中动脉起始端堵塞大脑中动脉。假手术组除不插入线栓外,余操作相同。动物麻醉清醒后参照longa等评分标准进行神经功能缺陷评分。0分:正常;1分:不能完全伸展左前肢;2分:左侧肢体瘫痪,行走时向左侧转圈;3分:行走向左侧跌倒、不能站立或打滚;4分:无自发活动,有意识障碍。1-3分为模型成功,0分和4分予以剔除。后续试验中补足每组动物数。

1.3 主要仪器和试剂

Trizol RNA提取试剂盒(美国lnvitrogen公司),Promega A3500逆转录试剂盒,大鼠脑立体定向仪,恒温烤箱,PCR仪(system9700型),DDY-7C型电泳仪,光密度扫描分析软件QuantiScan 3.0,依达拉奉(积华尤敏)规格:5 ml:10 mg。批号100131昆明积大药业制药有限公司。

1.4 药物的实施方法

C组造模成功术后经腹腔注射给予依达拉奉3 mg◦kg-1。以后每隔12 h予以相同剂量方式给药。B组予以等量的生理盐水腹腔注射。假手术组不予给药。

1.5 脑水含量的测定

采用干、湿重法。动物于规定时点处死后,断头取脑,取病变侧脑组织标本。首先用电子天平称取湿重。然后,将标本放入105℃恒温烤箱内烘干24-48 h至恒重,称取干重。脑水含量用湿重的百分比表示,脑水含量%=(湿重-干重)/湿重 ×100%。

1.6 RT-PCR方法

实验结束时各组动物分别于恢复再灌注后3 h 6 h 12 h 24 h 48 h 72 h 96 h,取缺血侧顶叶大脑皮质约100 mg,即冠状面距额极6 mm大约6 mm厚的脑组织块。按照Trizol RNA提取试剂盒(美国lnvitrogen公司)说明提取总RNA,测定RNA浓度。采用Promega A3500逆转录试剂盒,按操作说明进行逆转录合成cDNA,以逆转录所得的 cDNA为模板进行PCR扩增。PCR引物参照文献设计MMP-9及内参照β-actin引物。引物序列为:MMP-9 5primer 5AAGGATGGTCTACTGGCAC3;MMP-9 3primer 5AGAG ATTCTCACTGGGGC3;β-actin 5primer 5ACTCCTACGTGGGCGACGAG3;β-actin 3primer 5CAGGTCCAGACG CAGGATGGC3。常规方法抽提细胞总RNA,紫外分光光度计测定RNA在波长260 nm和280 nm的吸光度,进行定量和纯度检测并用电泳法鉴定其分子完整性。室温静置10 min,42℃60 min,70℃10 min,4℃5 min进行逆转录反应;逆转录后的cDNA保存于-20℃。反应循环参数为:94℃预变性5 min;94℃30 s,52℃30 s 72℃30 s 37个循环;72℃延伸7 min。RT-PCR产物的分析和定量:取10 μ l PCR扩增产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳。电泳结束后进行电泳条带光密度分析,以靶基因条带光密度参数与内参基因β-actin条带的光密度参数比值作为该标本mRNA的表达水平参数。

1.7 统计学处理

采用SPSS 16.0统计软件包对数据进行处理,实验资料以均数±标准差表示,多组间用单因素方差分析,两组间比较用独立样本q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠不同时间点脑组织含水量(%)比较

从表1可见。制模后6 h依达拉奉组与盐水组大鼠脑组织含水量(%)开始上升,至48 h达到峰值,而后下降,到96 h基本接近24 h水平。依达拉奉组与盐水组在7个时间点,脑组织含水量(%)均大于假手术组(P＜0.05)。依达拉奉组在这7个时间点脑组织含水量(%)均小于盐水组(P＜0.05)。

表1 各组大鼠不同时间点脑组织含水量(%)比较(±s)n=10

表1 各组大鼠不同时间点脑组织含水量(%)比较(±s)n=10

注:与假手术组比较,aP＜0.05;与盐水组比较,bP＜0.05

组别 3 h 6 h 12 h 24 h 48 h 72 h 96 h假手术组 77.21±0.01 77.32±0.03 77.36±0.01 77.45±0.02 77.42±0.01 77.39±0.01 77.36±0.02盐水组 78.01±0.02a 78.23±0.02a 80.07±0.01a 82.11±0.01a 84.88±0.02a 83.47±0.01a 82.21±0.02a依达拉奉组 77.23±0.01ab 77.25±0.01ab 78.77±0.02ab 80.53±0.02ab 82.59±0.01ab 81.74±0.02ab 81.03±0.01ab

2.2 各组大鼠不同时间点脑组织MMP-9mRNA表达水平比较

从表2可见,3 h依达拉奉组与盐水组大鼠脑组织MMP-9mRNA表达开始上升,至48 h达到峰值,而后下降,依达拉奉组与盐水组在7个时间点,脑组织MMP-9mRNA表达水平均大于假手术组(P＜0.05)。依达拉奉组在这7个时间点脑组织MMP-9mRNA表达水平均小于盐水组(P＜0.05)。

表2 各组大鼠不同时间点脑组织MMP-9mRNA表达水平比较(MMP-9/β-actin ±s)n=10

表2 各组大鼠不同时间点脑组织MMP-9mRNA表达水平比较(MMP-9/β-actin ±s)n=10

注:与假手术组比较,a P＜0.05;与盐水组比较,b P＜0.05

组别 3 h 6 h 12 h 24 h 48 h 72 h 96 h假手术组 0.189±0.033 0.191±0.025 0.199±0.022 0.193±0.031 0.201±0.025 0.196±0.024 0.191±0.030盐水组 0.242±0.023a 0.363±0.022a 0.541±0.019a 0.626±0.027a 0.852±0.026a 0.701±0.019a 0.657±0.023a依达拉奉组 0.212±0.018ab 0.272±0.021ab 0.323±0.025ab 0.405±0.018ab 0.557±0.027ab 0.514±0.022ab 0.458±0.020ab

2.3 盐水组大鼠不同时间点脑组织脑水含量与MMP-9mRNA表达的相关分析 脑水含量与MMP-9mRNA表达的变化规律一致,相关分析结果为r=0.779,P＜0.05,表明二者具有正性相关。

3 讨论

脑缺血早期,脑组织损伤是以能量耗竭、兴奋性毒性反应、钙离子超载、自由基损伤为顺序发生的;晚期则以炎症反应为主,级联反应使损伤进入恶性循环,神经元出现凋亡或坏死,给患者造成严重的神经功能缺损[6,7]。MMP-9是Ⅳ型胶原酶,又称明胶酶B,是MPPs的一种。MPPs能降解几乎细胞外基质的所有成分,以往发现其在肿瘤疾病中有可能成为肿瘤预后的有用标记物[2],近来研究发现MPP-9的激活能降解脑血管上的关键蛋白质,这些成分的降解能破坏血管结构的完整性,破坏血脑屏障,导致渗漏和破裂。正常状态下,脑血管内皮细胞可以不表达或仅少量阳性表达MMP-9[8]。在脑梗死的发生的病理过程中,脑动脉梗塞后,产生了一系列的缺血级联反应和一系列的细胞坏死因子,可能其中的某些细胞因子能诱导MMP-9酶原使MMP-9表达显著增加。这提示MMP-9可能在脑缺血的发生和发展有密切的关系,如果能在脑缺血形成的早期及时控制MMP-9的过度表达,将有可能利于减轻脑组织损伤,增强血管结构的完整性,保护血脑屏障。依达拉奉是一种新开发的具有捕获羟自由基活性的抗氧化剂。研究显示,依达拉奉分子量小,具有亲脂基团,血脑屏障的通透性高达60%,依达拉奉可阻止脑水肿和脑梗塞的进展,减少缺血半暗带发展成梗死的体积,并缓解所伴随的神经症状,抑制迟发性神经元死亡。机理研究提示,依达拉奉可清除自由基,抑制脂质过氧化,从而抑制脑细胞、血管内皮细胞、神经细胞的氧化损伤,保护血管内皮细胞和神经元[9-11]。临床研究结果也表明依达拉奉在脑梗死治疗中有显著神经保护作用。

Badaut等[12]的研究证实脑细胞内水肿在缺血2-3天时达到高峰,以后逐渐下降。本研究采用大鼠脑组织含水量测量与PCR法检测MMP-9mRNA的表达的方法。结果显示,脑缺血后MMP-9mRNA的表达在48小时内逐渐增加,在48小时达到高峰,其后逐渐下降的变化过程。表明MMP-9与缺血后细胞水肿有着密切的关系,可能参与了细胞水肿的形成。依达拉奉组给予药物处理后各时间点脑组织含水量明显下降,MMP-9mRNA表达量也显著下调,并具有统计学意义,这表明在缺血性脑水肿形成过程中,MMP-9基因与脑水肿变化呈正相关,这一结果一方面进一步证实MMP-9mRNA表达增强可能是形成细胞内水肿的关键因素之一。另一方面表明依达拉奉干预可抑制MMP-9mRNA表达。而细胞内水肿是脑缺血后重要的病理过程,它可以使血管通透性增加,引起脑间质水肿,压迫血管,进而加重脑组织缺血缺氧,形成恶性循环,导致更多的神经元坏死,加重神经功能损伤。我们推测依达拉奉可能通过抑制MMP-9表达,从而减轻细胞内水肿,从而减少这种恶性循环的发生,减少神经元坏死及改善神经功能的预后。

然而目前尚不清楚脑缺血再灌注损伤通过何种具体机制引起脑MMP-9表达增加。脑缺血再灌注后依达拉奉干预可减少MMP-9mRNA的表达,同时还发现依达拉奉减轻脑水肿,减轻神经细胞损伤方面具有显著脑保护,从而可能在临床工作中延长急性脑梗死治疗的时间窗,显著减轻脑缺血再灌注损伤后神经损伤。同时有研究证明依达拉奉可以减少脑缺血再灌注后水通道蛋白的表达,进而增加脑保护作用。说明依达拉奉的脑保护作用机理可能不仅是一种机制,这还需要进一步研究证明。

[1]Nomura H,Sato H,Seiki M,et al.Expression of membrane-type matrix metalloproteinase in human gastric carcinomas[J].Cancer Res,1995,55(15)∶3263.

[2]赵仲生,张 梅,茹国庆.MMP-2和MMP-9在非小细胞肺癌中的表达及预后意义[J].中国肺癌杂志,2000,3(2):105.

[3]Zhang N,Komine-Kobayashi M,Tanaka R,et al.Edaravone reduces early accumulation of oxidativeproducts and sequential inflammatory responses aftertransient focal ischemia in mice brain[J].Stroke,2005,36:2220.

[4]邱晓峰,尹 琳.依达拉奉对脑出血大鼠血肿周围脑组织氧化损害保护作用的研究[J].锦州医学院学报,2006,27:382.

[5]Belayev L,Alonso OF,Busto R,et al.middle cerebral artery occlusion in the rat by intraluminal suture[J].Stroke,1996,27(9):1616.

[6]Lipton P.ischemic cell death in brain neurons[J].Physiol Rev,1999,79:1431.

[7]Graham H,Chen J.Programmed cell death in cerebral ischemia[J].J Cereb Blood Flow Metab,2001,21:99.

[8]CuznerML,Gveric D,Strand C,et al.The expression of tissue-type plasminogen act ivator,matrix metalloproteases and endogenous inhibitors in the central nervous system in multiple sclerosis:comparison of stages in lesion evolution[J].J Neuopathol Exp Neurol,1996,55:1194.

[9]Yamawaki M,Sasaki N,Shimoyama M,et al.Protective effect of edaravone against hypoxia-reoxygenation injury in rabbit cardiomyocytes[J].Br J Pharmacol,2004,142(3):618.

[10]Yasuoka N,Nakajima W,Ishida A,et al.Neuroprotection of edaravone on hypoxic-ischemic brain injury in neonatal rats[J].Brain Res Dev Brain Res,2004,15(1-2):129.

[11]Banno M,Mizano T,Kato H,et al.The radical scavenger edaravone prevents oxidative neurotoxicity induced by peroxynitir and activatedmicroglia[J].Neurophrmacology,2005,48(2):283.

[12]Badut J,Lasbennes F,Magistretti PJ,et al.Aquaporins in brain:distribution,physiology,and pathopysiology[J].J Cereb Brood Flow Metab,2002,22(4):367.