大黄对急性胰腺炎T淋巴细胞亚群的改变的影响

姜良富

急性胰腺炎(Acute pancreatitis，AP)是腹部外科常见病，其中，急性重症胰腺炎(Acute sever pancreatitis，SAP)起病急骤，病情凶险，最近的研究提示，免疫异常在AP的病情恶化中起着关键作用。越来越多的学者认为AP的发病和免疫异常有关，Liras等[1]观察到重症胰腺炎病人巨噬细胞吞噬功能尤其低下，实验表明单核巨噬系统的预激和激活是AP免疫紊乱发展过程中的重要环节，有关AP患者的免疫功能变化很复杂，目前针对这一领域的研究不多，与AP的关系尚不明了，本研究采用Wistar大鼠经胰管逆行注入5%牛磺胆酸钠溶液复制SAP模型，用流式细胞仪检测AP大鼠外周血中T淋巴细胞亚群的变化，并进行大黄的实验治疗学研究，为其临床应用提供科学的实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物分组与模型制备

将健康Wistar大鼠20只随机分为二组：SAP模型组(M组，n=10)和SAP大黄治疗组(T组，n=10)，所有动物术前禁食12小时，禁水6小时，3%戊巴比妥钠溶液腹腔内注射(30mg/kg)麻醉，麻醉成功后固定四肢，腹部备皮，碘酒，酒精消毒切口后铺巾，按外科无菌要求手术，采用上腹壁正中切口入腹，寻及十二指肠及胰胆管，用一小动脉夹夹闭胆管近肝端，1号丝线结扎胰胆管近肠端，并用41/2#皮试针头刺入胰胆管肠端，M组以0.2ml/min的速度向胰胆管内逆行推注5%牛磺胆酸钠溶液(0.1ml/100g)，推注过程中即见胰腺出血，水肿，注毕压迫肠端5分钟后见胰腺明显出血坏死后去除小动脉夹及丝线；T组按M组方式复制SAP模型，关腹后即刻给以大黄素溶液1ml(5mgl/100g)胃内注射，M组动物手术后给以生理盐水1ml胃内注射，术后分笼饲养，自由饮水，术后24小时，M组和T组大鼠予以3%戊巴比妥钠溶液(10～20mg/kg)腹腔内注射麻醉，无菌条件下行颈动脉插管，抽血3ml作细菌培养及流式细胞仪检测，并在无菌条件下剖腹切取胰腺及肠系膜淋巴结作细菌培养，取相同部位的胰腺及回肠组织作光镜检查。

1.2 观察项目

1.2.1 一般状况

观察术后动物精神状态，活动反应，饮水，毛是否光顺等情况。

1.2.2 腹水

第二次开腹后观察腹水颜色并记录量；

T淋巴细胞亚群检测方法:采血样1.8ml，加预先配置的肝素抗凝剂0.2ml混匀，取专用试管2支，各管依次加入CD4-FICT及CD8-FICT单克隆抗体各20μl及肝素抗凝血100μl，充分混匀，置室温避光保存20分钟后每管加入溶血剂2ml充分混匀，避光保存10分钟，2000r/min，离心5分钟，弃上清；用PBS洗涤三遍，加入PBS0.5ml，样本在流式细胞仪上进行检测。

1.2.3 数据处理

实验数据按完全对照设计的要求收集，整理，建立数据库，采用spss11.0 for windows统计软件包进行数据分析，数据以均数加减标准差(±s)，组间数据比较采用方差分析(F检验)。

表1 二组动物腹水量的变化(±s)

表1 二组动物腹水量的变化(±s)

注:T与M组比较P＜0.01。

组别 n 腹水量(ml)M 10 10.18±2.50 T 10 3.79±1.17

表2 二组动物血中CD4+/CD8+浓度以及CD4+/CD8+的变化(±s)

表2 二组动物血中CD4+/CD8+浓度以及CD4+/CD8+的变化(±s)

注:△与M组比较，P＜0.05；△*与*比较P＞0.05。

组别 n CD4+ CD8+ CD4+/CD8+M 10 32.30±7.21# 51.45±7.13 0.64±0.12*T 10 38.42±4.55△ 43.35±11.77 0.95±0.24△*

2 结果

2.1 动物一般情况

大鼠苏醒后，M组大鼠精神萎靡,卷屈,不愿活动，有的不能站立，反应差，全身肌张力低，不愿饮水,T组大鼠精神状态较M组好。

2.2 腹腔内脏器大体病理变化

M组第二次开腹麻醉药仅需正常剂量的1/3～1/2，剖腹后见胃和肠壁极度扩张，积液积气明显，肠管呈暗红和紫红色，大网膜及肠系膜上可见广泛皂化斑，胰腺水肿明显，呈暗红色，并可见大面积的出血，坏死灶，T组一般情况较M组为轻，胃肠轻度扩张，积液积气较少，胰腺轻度肿胀，可见散在小面积的出血，坏死灶，第二次麻醉药亦仅需正常剂量的1/3～1/2，腹腔内皂化斑减少，呈零星散在状。

2.3 腹水情况

M组动物腹腔内有大量腹水，浑浊，为黄色和血性积液，T组腹腔内仅见少量和中等量腹水，且多为淡黄色，从表1中可见，M组，T组动物的腹水量均升高；T组动物的腹水量较M组明显下降(P＜0.01)。

2.4 血中CD4+/CD8+阳性细胞数以及CD4+/CD8+变化

用FCM测定各组大鼠外周血T淋巴细胞亚群，发现M组大鼠血中CD4+阳性细胞数及CD4+/CD8+的值明显下降，显著低于T组(P＜0.05)；二组间CD8+阳性细胞数比较无明显差异(P＞0.05)。详见表2。

3 讨论

AP的启动及病情演变机制十分复杂，除胰酶激活自身消化胰腺的损伤机理外，粒细胞过度激活，细胞因子的“瀑布反应”及胰管压力过高等均参与了AP的发生与发展的过程[2]。抑制胰腺外分泌和降低酶活性的传统治疗并未显著改变AP的预后，最近的研究提示，免疫异常在AP的病情恶化中起着关键作用，越来越多的学者认为AP的发病和免疫异常有关，因此从免疫学角度探讨AP的发病机制，寻求免疫疗法阻止AP的病情发展是当今外科值得研究的课题。

3.1 急性胰腺炎与免疫

自20世纪90年代以来，人们对急性胰腺炎病程中的免疫异常进行了大量的研究，但研究的重点主要集在炎症过激反应和炎性细胞因子的病理损害和相应治疗方面，而对机体细胞免疫功能研究甚少[3-4]，在感染和损伤的动物模型和临床研究中已经观察到，在全身炎症反应综合征(SIRS)中的发展过程中，随着炎症介质的大量释放，抗炎症因子的合成与释放也相应启动，并在SIRS后期成为优势效应，这些抗炎因子在抑制炎症反应的同时也抑制机体对病原体的免疫作用，特别是抑制细胞免疫功能，导致代偿性抗炎反应综合征(CARS)[5]，新近研究表明，重症急性胰腺炎是一种全身炎症反应综合征(SIRS)，因此它可能存在着细胞免疫功能的紊乱。

本实验参照Lankisch等[6]的方法并进行改良，复制大鼠的SAP模型，复制模型24小时后，M组可见胰腺明显水肿，呈灰褐色，胰头周围及肠系膜可见皂化斑形成，镜下可见胰腺有大片出血，坏死灶，红细胞外渗成团，间质，导管，动脉内及管周大量中性粒细胞浸润，部分有小脓肿形成；胰腺腺泡水肿呈角状，这些都极似临床上的SAP[7-8]，流式细胞仪检测M组动物血CD4+阳性细胞数和CD4+/CD8+的值明显降低，相反，SO组动物反应较好，胰腺无水肿，出血及坏死，无腹水及胰周皂化斑，胃肠不积液积气和扩张，血CD4+阳性细胞数和CD4+/CD8+的值明显高于M组，T淋巴细胞亚群是构成机体免疫系统的重要因素，体内通过辅助性T细胞CD4+和抑制性T细胞CD8+形成的T细胞网络来维持调节免疫功能的平衡[9]，二者的升高与降低，均可使两者的比例失调，导致机体免疫功能的异常或紊乱[10]。CD4+T细胞和CD8+T细胞两者通过直接作用和其分泌的细胞因子，在机体免疫应答的调控和维持免疫稳定方面具有重要作用，CD4+T细胞为辅助/诱导T淋巴细胞(Th/Ti)，Ti细胞成熟诱导Th，TS细胞的成熟，这类细胞在细胞免疫的效应阶段能产生多种细胞因子，导致炎症反应，从而加速消除抗原物质，CD8+细胞可对靶细胞产生细胞介导的细胞毒作用，即直接杀伤带有特异性抗原的细胞或相应的靶细胞，对CD4+细胞具有调节性抑制作用，烧伤，创伤及输入内毒素后均能引起CD4+T细胞比例降低，出现相应的免疫缺陷症状，并与烧伤、创伤脓毒症发生相关的迟发性皮肤高敏反应有关，反应了机体细胞免疫功能的降低[11-12]，因此CD4+细胞百分比和CD4+/CD8+的值可部分反映SAP病人的细胞免疫功能，许多学者认为SAP病人细胞免疫功能减退，这是SAP感染并发症和死亡率的重要原因，本实验中发现，M组CD4阳性细胞百分比和CD4+/CD8+的比值均较正常对照组明显降低，统计学分析有显著性差异，CD4+T细胞一方面可分泌IL-2，它可促进单核巨噬细胞分泌IL-1，另一方面可使静止的T细胞表达IL-2受体，后者与IL-2结合，引起不同的免疫反应，并导致淋巴细胞DNA合成增强，所以CD4+T细胞减少势必影响机体的免疫功能，导致机体抵抗力降低，同时发现M组CD8阳性细胞百分比没有下降，与正常组相比无显著差异，以上结果表明SAP时，不仅胰腺炎症改变严重，而且还存在明显的细胞免疫功能抑制，其主要原因是SAP病程中组胺、缓激肽和许多细胞因子的变化对免疫系统具有抑制作用，引起CD4阳性细胞百分比下降明显，CD8阳性细胞百分比正常，从而加重CD8细胞对CD4细胞的抑制作用，并导致CD4+/CD8+的比值降低，引起细胞免疫功能的严重破坏。

3.2 大黄对急性胰腺炎的治疗研究

祖国医学本着六腑以通为用的基本理论，采用大黄等泻下药物治疗急性胰腺炎，取得了显著的临床治疗效果[13]，但其确切机理仍不清楚，现代研究认为:大黄具有改善微循环，改善肠麻痹，降低炎性介质，抑制肠菌及清理肠道等作用，高雅萍[14]认为大黄具有抑制胰蛋白酶，胰脂肪酶的活性和释放的作用，对胰腺细胞膜有保护作用，使胰酶及降解产物不能侵入细胞，对内毒素性发热及肠道内毒素有明显的抑制作用，能显著地降低血浆内毒素水平，同时发现大黄能保护肠粘膜屏障，清除氧自由基，对多脏器损伤有保护作用。

本研究发现，经大黄治疗后的T组动物精神状态等一般情况较M组好，胰腺水肿，出血及中性粒细胞浸润较M组明显减轻，镜下腺泡水肿减轻，炎性细胞浸润减轻，仅有点灶状坏死出血灶，无小脓肿形成；回肠粘膜间质水肿，淋巴管扩张及中性粒细胞浸润较M组减轻，绒毛基本完整无水肿，M组动物腹腔内有大量腹水，浑浊，为黄色和血性积液，经大黄治疗后的T组腹腔内仅见少量和中等量腹水，腹水量较M组明显下降，且多为淡黄色，以上结果表明，大黄对SAP确实有一定的治疗作用，它具有保护胃肠黏膜屏障，抑制细胞因子的分泌，阻止重症感染患者的病程向多脏器功能衰竭演变的重要作用[15]，T组动物胰腺病变较轻，说明大黄还可使病态胰腺细胞之间的紧密连接处恢复正常，对胰腺细胞具有保护作用，同时T组血CD4+阳性细胞数和CD4+/CD8+的值明显高于M组，而血及脏器细菌培养阳性率明显低于M组，血CD4+阳性细胞数及CD4+/CD8+的比值增高可增强机体的细胞免疫功能，纠正免疫紊乱，同时促进B细胞的活化与分化，增强体液免疫，以上结果表明大黄可以通过升高SAP动物血CD4+阳性细胞数和CD4+/CD8+的值，从而增强机体的细胞免疫功能阻止SAP的病程发展。

本研究结果表明，病程早期采取有效的措施防止机体免疫紊乱提高免疫功能，是预防和治疗SAP后继发感染的重要原则，应用中药大黄从免疫的角度治疗SAP值得我们进一步的研究。

[1]Liras G,Carballo F.An impaired phgosytic function is associated with leucocyte activation in the early stage of sever acute pancreatitis[J].Gut,1996,39:39.

[2]GrossV,Leser HG,Heinisch A,et al.Inflammatory mediators and cytokinesNew aspects of the pathophysiology and assessment of severity acute pancreatitis[J].Hepato-Gastroenterol,1993,40:522-530.

[3]Schlag G,Redl H.Mediators of injury and inflammation[J].World J Surg,1996 May,20(4):406-410.

[4]Sirianni MC,Annibale B,Fais S.Inhibitory effect of somatostatin-14 and some analogues on human natural killercell activity[J].Peptides,1994,15(6):1033-1036.

[5]Lankisch PG,I Ihse.Bile-induced acute experimental pancreatitis[J].Scand J Gastroenterol,1987,22:257-260.

[6]Schmidt T,Lewandrowski K,Fernandez-Del CC,et al.Histopathologic correlates of serum amylase activity in acute experimental pancreatitis[J].Dig Dis Sci,1992,37:1426-1433.

[7]Aho HJ,Koskensalo SM-L,Nevalainen TJ.Experimental acute pancreatitis in the rat:Sodium taurocholate-induced acute hemorrhagic pancreatitis[J].Scand J Gastroenterol,1980,15(4):411.

[8]Notarangelo,L.D.,P Panina,L.Im berti,et al.Neonatallymphocytes:analysis of the expression of 4B4 and 2H4 antigens[J].clin.Im Immupopathol,1988,46:61.

[9]Li XM,Chen JZ,Zhang NY,et al.Association of TCM-bionzheng with T lymphrocytesubsets and thyroidism in patients with diabetes mellitus[J].Di-si JunyiDaxue Xuebao(J Fourth Mil Med Univ),2000,21(2):233-234.

[10]Richardson RP,Rhyne CD,Fong Y.Peripheral blood leukocyte kinetics following in vivo lipopolysaccharide (LPS)administration to normal human subjects.Influence of elicited hormones and cytokine[J].Ann Surg,1989 Aug,210(2):239-245.

[11]Horgan PG,Mannick JA,Dubravec DB.Effect of low dose recombinant interleukin 2 plus indomethacin on mortalityafter sepsis in a murine burn model[J].Br J Surg,1990 Apr,77(4):401-404.

[12]Kleef J,Friess H,et al.Immune function in the early stage of acute pancreatitis[J].Z Gastrointest Surg,2000,4:379-387.

[13]焦东海,沈学敏,景炳文.单味大黄治疗急性胰腺炎I7年研究[J].中医杂志,1994,35(3):172.

[14]高雅萍,焦东海,华宝芬.重用大黄中西医结合治疗出血坏死性胰腺炎的疗效观察[J].中国中西医结合外科杂志,1995,1(3):130-132.

[15]焦东海.大黄在急救医学中的应用概述[J].中国中西医结合急救杂志,2000,7(1):3-4.