绞股蓝皂苷酶转化产物的分离纯化及鉴定
2010-09-19柳海，杨宇，金凤燮，鱼红闪
柳 海，杨 宇，金 凤 燮，鱼 红 闪
（大连工业大学 生物与食品工程学院，辽宁 大连 116034）
0 引言
绞股蓝 ［Gynostemmapentaphyllum（Thunb.）Makino］，为葫芦科绞股蓝属植物［1］。传统中医用以治疗咳嗽、痰喘、慢性气管炎、传染性肝炎等疾病。近代医学研究表明，绞股蓝对神经系统、血液循环系统、呼吸及消化系统疾病均有防治作用［2］。
绞股蓝中含有多种化学成分［3-4］，其中以绞股蓝皂苷为主要的药理活性成分。迄今发现的绞股蓝皂苷达136种，它主要是由四环三萜达玛烷型绞股蓝皂苷元与糖基组成［5］。在诸多的绞股蓝皂苷中有绞股蓝皂苷Ⅲ、Ⅳ等分别与人参皂苷Rb1、Rb3结构完全相同。根据绞股蓝皂苷与人参皂苷的苷元母环结构相同的特点，可以利用生物酶对绞股蓝皂苷上的糖基进行改造，进而制备人参皂苷。本实验室在前期的工作中筛选到这种生物酶，并对其反应进行了研究［6］。本文针对利用生物酶反应制备的绞股蓝皂苷酶解产物进行分离纯化，制备得到单体化合物，并对其进行初步鉴定。
1 材料与方法
1.1 实验材料
绞股蓝皂苷酶解产物20g，实验室自制；人参皂苷Rd标准品，实验室自制；薄层层析板Silica，德国Merck公司；硅胶，青岛海洋化工厂；Waters 2695高效液相色谱仪，美国生产。
1.2 实验方法
1.2.1 硅胶柱分离纯化绞股蓝皂苷酶解产物
样品胶的制备：准确称取一定量待分离的绞股蓝皂苷酶解产物，用5倍体积的氯仿甲醇溶液［V（氯仿）∶V（甲醇）=1∶1］在60 ℃水浴中完全溶解后，加入1.5 倍样品质量的硅胶，其目数是80～100目，搅拌均匀，继续在水浴中加热，直至溶剂挥发干燥后，颗粒均匀而不腻手，即成样品胶。
装柱：装柱时先用一小块脱脂棉堵住柱底，然后取适量300～400目的硅胶缓慢倒入柱中，轻轻敲打柱子两侧，至硅胶界面不再下降为止；将制备好的样品胶倒入柱中后，利用真空泵抽实，最后在顶部盖上一层约5mm 厚的脱脂棉。
梯度洗脱：硅胶柱装好后，先用氯仿通柱；再依次按V（氯仿）∶V（甲醇）=9∶1、8∶2、7∶3的梯度洗脱样品，利用薄层层析法对收集的样品进行跟踪检测，分部收集洗脱液。
1.2.2 薄层层析法（TLC）检测绞股蓝皂苷酶解产物的分离情况
用微量点样器吸取分部收集的洗脱液，点样于薄层层析板上，点样量为10μL，利用展开剂展开。展开剂的配比为V（氯仿）∶V（甲醇）∶V（水）=7∶3∶0.5，显色剂为10%硫酸溶液，121 ℃显色10min。
1.2.3 高效液相色谱法测定分离单体的纯度
利用高效液相色谱仪对分离得到的单体皂苷进行纯度的检测及皂苷种类的初步鉴定。仪器，Waters2695；色谱柱，Hypersil ODS2（4.6 mm×250mm，5μm）不锈钢填充柱；进样量，10μL；体积流量，1.0 mL/min；柱温，35 ℃；流动相，乙腈（A）-水（B）梯度洗脱；检测波长，203nm；洗脱程序如表1所示。
表1 高效液相色谱流动相梯度洗脱程序Tab.1 The developing procedure of HPLC flowing form
2 结果与讨论
2.1 硅胶柱分离绞股蓝皂苷酶解产物
准确称取绞股蓝皂苷酶解产物20g，加入甲醇和氯仿各50 mL 充分溶解后，加入30g 80～100目硅胶制成样品胶。取300～400 目硅胶300g作为分离胶装柱，加入80～100目硅胶15g作为缓冲区域，填加样品胶，盖上脱脂棉，抽实。首先用纯氯仿通柱，再依次采用氯仿-甲醇洗脱液［V（氯仿）∶V（甲醇）=9∶1、8∶2、7∶3］进行梯度洗脱，每次洗脱200mL，采用TLC法进行跟踪检测，直至这一梯度没有物质被洗脱出来时更换下一个梯度。分部收集洗脱液。TLC 法跟踪检测如图1所示。
图1 硅胶柱分离TLC图谱Fig.1 Separation by silica gel column
由图1可以看出，绞股蓝皂苷酶解产物中主要含有3种物质。氯仿通柱后先用氯仿-甲醇洗脱液进行洗脱［V（氯仿）∶V（甲醇）=9∶1］，收集到1～6号样品，由图1可知收集到的样品中皂苷含量极少；更换洗脱液的洗脱梯度［V（氯仿）∶V（甲醇）=8∶2］后，有少量主要酶解产物被洗出，且随着洗脱的进行，收集到的样品中产物2的含量逐渐增大，在19号样品中产物2的量达到最大值，随后其含量又逐渐减少；收集到24号样品时更换了洗脱梯度［V（氯仿）∶V（甲醇）=7∶3］，收集到的样品25～31中仍有少量产物2，可能是上一梯度洗脱不够充分所致。由图1可以清晰地看出分部收集的样品中13～24号样品所含的产物2较纯，因此将这部分样品一起收集。将收集到的产物2的样品液经旋转蒸发得干品5.06g，其得率为25.3%。
2.2 酶解产物的纯度检测及物质的初步鉴定
将分离纯化得到的酶解产物单体及人参皂苷Rd的标准品进行HPLC 检测，检测结果如图2所示。
图2 绞股蓝皂苷酶解产物分离鉴定HPLC图谱Fig.2 HPLC of gypenoside hydrolysate and its purification product
由图2 可见，绞股蓝皂苷酶解产物中含有5～6种组分，样品混杂，其中保留时间在39.025min的物质含量相对较高。该样品经硅胶柱梯度洗脱，纯化得到的样品HPLC 图谱（c）中，保留时间在39.003min的物质纯化效果好，其他的杂质峰很少。
图2（a）是人参皂苷Rd的标准品，其HPLC中的保留时间为39.038min，而图2（b）、2（c）中在相应保留时间处也有峰型存在。尤其是图2（a）和2（c）比较，两图中的出峰保留时间分别是39.038和39.003min，同时绞股蓝皂苷与人参皂苷的苷元母环都是四环三萜达玛烷型结构，根据这些相同的结构特点，初步鉴定绞股蓝皂苷酶解产物分离纯化样品可能为人参皂苷Rd。
3 结论
实验通过对绞股蓝皂苷酶解产物的分离纯化，得到了纯度较高的单体化合物。该化合物经HPLC检测，与人参皂苷Rd比较发现两者的出峰时间相同；同时，由于二者结构相似，初步确定产物为人参皂苷Rd，为利用绞股蓝总皂苷为底物，采用生物酶法制备人参皂苷以及相关的开发应用提供了科学依据。
