纳豆制备过程中大豆异黄酮的转化条件

陈 雅 欣，黄 燕，单 婷 婷，富 瑶 瑶，芦 明 春，鱼 红 闪，金 凤 燮

（大连工业大学 生物与食品工程学院，辽宁 大连 116034）

0 引言

纳豆是日本常见的传统发酵食品，由黄豆通过纳豆菌（枯草杆菌）发酵制成。纳豆中的大豆异黄酮具有降血压、抗肿瘤、抗氧化性、溶血栓等作用［1］。大豆异黄酮是一种植物雌性激素，共有12种不同结构，其中有9种结合型糖苷和3种游离型苷元［2］。大豆异黄酮一般情况下以糖结合的苷类形式存在，主要为染料木苷和大豆苷，约占总量的97%～98%，而游离型的苷元仅占2%～3%［3］。糖苷须在大豆异黄酮糖苷水解酶作用下转化成游离的苷元形式才能发挥抗癌、抗氧化等相应的生物学功能，其作用是未水解前糖苷的30倍。大豆异黄酮因其明显的生物学活性引起学术界的普遍关注，但和纳豆制品相结合的报道相对较少，这对得到高品质的保健食品具有实际意义。王莉等［4］曾用菌种Bacillusnatto918研究了纳豆发酵过程中大豆异黄酮的变化。本文以得到大豆异黄酮苷元含量高的纳豆制品为目的，采用古法制备纳豆，从中分离出高活性的纳豆菌。进行发酵，从发酵液中提取了大豆异黄酮，考察了在不同时间、pH、含水质量分数、温度下大豆异黄酮转化为大豆异黄酮苷元的情况。

1 材料与方法

1.1 实验材料

采用日本古法制备纳豆，以从制备纳豆中筛选出的纳豆菌为实验菌种。薄层层析板Kiesel gel 60F254，德国Merck公司。

培养基：配制100g 培养基，分别称取蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、葡萄糖、NaCl各0.5g，琼脂2g，调节pH 7.5，121 ℃灭菌20min。

1.2 实验方法

1.2.1 纳豆的制备

称取适量经冷去离子水浸泡24h的稻草平铺于大烧杯内，将适量蒸煮过20min的黄豆平铺于稻草之上，最后在黄豆上再平铺一层上述经冷去离子水浸泡过的辽阳稻草，置于37℃恒温培养培养24～48h。

1.2.2 菌种的筛选

无菌条件下称取适量制备好的纳豆，加入10倍体积的质量分数为0.7%的NaCl，搅拌均匀后采用0.7% NaCl对其进行梯度稀释，梯度分别为10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，将稀释菌液分别涂布于培养基上，于37℃进行恒温培养。待长出菌体后，选择长有较多单个菌落的稀释度的平板，进行斜面培养。斜面培养接种量为1 环，于37 ℃进行扩大培养。

1.2.3 大豆异黄酮的提取与测定［5-7］

将采用古法制备的纳豆中加入6 倍体积的80%乙醇在70 ℃浸提3h，浸提液经冷却离心（4 ℃，5 000r/min，5min），所得上清液即为大豆异黄酮粗提物。采用TLC 检测，点样量为5μL，展开剂为乙酸乙酯-丁酮-甲醇-水（体积比为10∶7∶1∶1），于254nm 下观测斑点，确定大豆异黄酮苷的转化情况。

1.2.4 纳豆制备条件的选择

培养时间的选择：将接入纳豆菌的大豆，置于37 ℃培养，pH 为7.0，含水质量分数为60%，接菌量3mL，发酵时间分别选择24、48、72、96h，确定最佳培养时间。

培养温度的选择：将接入纳豆菌的大豆，分别置于34、37、40、44 ℃发酵培养，pH 为7.0，含水质量分数60%，接菌量3mL，培养48h，确定最佳培养温度。

pH 的选择：将接入纳豆菌的大豆，置于37 ℃培养，含水质量分数60%，接菌量3 mL 时培养48h，调发酵pH 分别为5.0、6.0、7.0、8.0，确定最佳培养pH 值。

含水质量分数的选择：将接入纳豆菌的大豆，置于37 ℃培养，pH 为7.0，接菌量3mL 时培养48h，培养时含水质量分数分别选择40%、50%、60%、70%，确定最佳培养含水质量分数。

接菌量的选择：将接入纳豆菌的大豆，置于37 ℃培养，pH 为7.0，含水质量分数60%，培养48h，接菌量分别选择1、2、3、4 mL，确定最佳培养接菌量。

2 结果与讨论

2.1 古法制备纳豆中菌种的筛选

如图1所示，在稀释度为10-5的培养基中出现较多单个菌落，因此选择该培养基中的菌落作为实验菌株，对其进行扩大培养。

图1 纳豆菌的菌落形态Fig.1 The shape of the natto strain

2.2 发酵条件对大豆异黄酮转化的影响

为研究古法制备纳豆过程中，各因素对大豆异黄酮转化的影响，考察了不同的发酵条件下（培养温度、培养时间、接菌量、pH、含水质量分数）大豆异黄酮的转化情况。采用薄层层析法检测。

2.2.1 培养温度的选择

如图2所示，发酵后染料木苷、大豆苷等其他带糖基的大豆异黄酮转化成相应的苷元。在37 ℃发酵条件下进行培养的转化效果优于其他温度。

图2 培养温度对大豆异黄酮转化的影响Fig.2 Effect of fermentation temperature on soybean isoflavone

2.2.2 培养时间的选择

如图3所示，24、72和96h培养的糖苷转化为苷元的转化率相差不大，但48h 明显优于三者，转化效果较好。

图3 培养时间对大豆异黄酮转化的影响Fig.3 Effect of fermentation time on soybean isoflavone

2.2.3 接菌量的选择

如图4所示，随着接菌量的增加，大豆异黄酮的转化效果逐渐明显。当接菌量达到3 mL 时，染料木苷、大豆苷的转化率最高，所以选择3mL为最佳接菌量。

图4 接菌量对大豆异黄酮转化的影响Fig.4 Effect of inoculation volume on soybean isoflavone

2.2.4 pH 的选择

如图5所示，pH 为7.0 时大豆异黄酮糖苷转化成苷元的效果较明显，可以选为最适pH。

图5 pH 对大豆异黄酮转化的影响Fig.5 Effect of pH on soybean isoflavone

2.2.5 含水质量分数的选择

如图6所示，大豆异黄酮苷转化成苷元的量随含水质量分数的增加而增大，在含水质量分数为60%转化率最大，含水质量分数为70%反而减少，因此选择60%为最佳含水质量分数进行培养。

图6 含水质量分数对大豆异黄酮转化的影响Fig.6 Effect of the water content on soybean isoflavone

3 结论

本文以得到大豆异黄酮苷元含量高的纳豆制品为目的，采用日本古法制备纳豆，以制备的纳豆中分离的纳豆菌作为出发菌株，发酵生产纳豆，以大豆异黄酮转化为大豆异黄酮苷元的效果为考察因素，确定出最适的发酵条件：培养温度37℃、培养时间48h、接菌量3 mL、pH 7.0、含水质量分数60%。在此最适发酵条件下，大部分大豆异黄酮苷转化为大豆异黄酮苷元。目前，市场上出售的大豆异黄酮中有97%为带糖基的糖苷型，水解转化成游离型的苷元能发挥更高的生理活性功能。