淫羊藿黄酮的高效液相色谱分析方法

朱 靖 博，邱 焕 杰，李 丹 凤

（大连工业大学 生物与食品工程学院，辽宁 大连 116034）

0 引言

淫羊藿（EpimediumHerb）又名仙灵脾，始载于《神农本草经》。本品辛、甘，温，入肝、肾经，是我国传统补益类中药［1］。临床上，淫羊藿黄酮类化合物用于治疗骨质疏松症的效果尤其显著［2-4］。淫羊藿属植物中的活性成分以黄酮类成分为主，大部分为8位具有异戊烯基取代的淫羊藿苷类黄酮成分［5］。2005 年版《中国药典》规定淫羊藿药材质量的控制指标为淫羊藿苷。

高效液相色谱技术被认为是中药质量控制的有效手段，黄朝瑜等以0.5%冰醋酸溶液和乙腈为流动相，建立了淫羊藿药材的指纹图谱，共检出7个峰［6］。郭青等得到了包括朝霍定A、B、C 以及淫羊藿苷一组峰的指纹图谱［7］。易中宏等以乙腈-水-36%醋酸溶液梯度洗脱的HPLC法比较研究巫山淫羊藿的不同部位［8］。但由于微量成分分离和标准样品缺乏等方面原因，以往HPLC 分析中对每个黄酮的定量分析研究较少。王丽霞以淫羊藿苷为内标，对不同淫羊藿属9个共有峰做了相对峰面积的分析［9］，但未进行定量分析。

利用HPLC对样品每个色谱峰进行定性、定量分析已成为中药质量控制的主要手段［12］。但标准对照品的缺乏是制约这类方法应用于定量分析的主要因素。本实验旨在建立以淫羊藿苷标准品为参照物，对其他淫羊藿黄酮进行相对定量，得到其他淫羊藿黄酮的相对含量，从而得到淫羊藿总黄酮的相对含量的方法，以期在一定程度上反映淫羊藿水提物的内在质量，为控制以淫羊藿黄酮为活性物质的药材及药品质量提供参考。

1 实验

1.1 仪器与试剂

DIONEX UltiMate3000高效液相色谱仪，美国戴安公司；P680 泵；ASI1000自动进样器；PDA100检测器；1810D 型自动双重纯水蒸馏器，上海申生科技有限公司；UV-2102PC紫外可见光分光光度计，尤尼柯上海仪器有限公司。

乙腈，色谱纯；甲醇、乙醇，分析纯；水，双重蒸馏水。

1.2 药 品

淫羊藿苷对照品，由中国药品生物制品检定所提供；淫羊藿提取物，购自西安保赛生物工程有限公司。

1.3 色谱条件

色谱柱：Sinochrom ODS-BP（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：A 为乙腈，B 为双重蒸馏水；乙腈浓度梯度：0～12min（20%～30%），12～20min（30%～36%），20～30 min（36%～58%）；洗脱时间：30min；体积流量：1.0mL/min；检测波长：270nm；进样量：20μL。

1.4 对照品溶液的制备

精确称取淫羊藿苷标准品1.12mg于10mL容量瓶中，甲醇定容，质量浓度为112μg/mL。分别取一定量标准品溶液稀释不同倍数，配成质量浓度为70、56、22.4、11.2、2.24μg/mL 的溶液，按“1.3”色谱条件分别进样分析。

1.5 供试品溶液的制备

称取淫羊藿水提物50g放置于2 000mL圆底烧瓶中，加入80%乙醇500mL，60℃水浴锅中提取2次，每次2h，过滤，合并滤液浓缩，10%乙醇溶解定容于500 mL 容量瓶，得10 mg/mL 溶液，用该溶液配制1mg/mL 溶液，0.45μm 微孔滤膜过滤，作为供试品溶液备用。

1.6 检测波长的选择

对照品溶液在紫外分光光度仪上进行扫描（190～400nm），确定淫羊藿黄酮类化合物的最大紫外吸收波长。

2 结果与分析

2.1 淫羊藿苷的紫外吸收光谱与标准曲线

对照品溶液紫外吸收光谱扫描的结果见图1（190～400nm），从而确定淫羊藿黄酮类化合物的紫外吸收光谱最大吸收在为270nm。

图1 淫羊藿苷紫外吸收光谱图Fig.1 Ultraviolet absorption spectrum of Icariin

对“1.4”制得的对照品溶液，通过液相色谱检测得到标准曲线线形回归方程：y=0.633 2x-0.390 8，R2=0.999 9。结果表明，在2.24～112μg/mL淫羊藿苷峰面积与质量浓度呈良好线性关系。

2.2 样品分析

淫羊藿苷和供试品溶液色谱分离结果如图2、3所示。图2中淫羊藿苷纯度为98.5%。该色谱条件对淫羊藿水提物进行分离得到13个分离良好的色谱峰。图3中的9号峰为淫羊藿苷。

图2 淫羊藿苷HPLC图Fig.2 Chromatogram of Icariin

图3 淫羊藿黄酮HPLC图Fig.3 Chromatogram of Epimedium Flavones

每种物质都有其特定的紫外吸收光谱，其紫外吸收光谱由物质的结构决定，类似结构的物质其紫外吸收光谱具有相似性，所以紫外吸收光谱可作为定性的依据之一［10-11］。利用HPLC-PDA检测13个色谱峰的紫外吸收光谱图见图4。从图1和图4可以看出，在该色谱条件下分离的13个峰，其紫外吸收光谱吸收与淫羊藿苷紫外吸收相同，可以推测这13个化合物都是淫羊藿黄酮类化合物。

图4 淫羊藿黄酮HPLC1～13色谱峰紫外吸收波谱图Fig.4 Ultraviolet absorption spectrum of peaks 1-13 of Epimedium Flavones Chromatogram

2.3 分析方法学考察

2.3.1 稳定性试验

将供试品溶液在室温下放置，按“1.3”色谱条件，分别在制备供试品后的0、5、10、15、20h，吸取20μL注入高效液相色谱仪，记录淫羊藿13个黄酮化合物的峰面积和保留时间，计算相对标准偏差。峰面积RSD为1.43%～4.03%，保留时间RSD为0.011%～0.65%。结果表明样品20h内是稳定的。

2.3.2 精密度试验

供试品溶液按“1.3”色谱条件连续进样5次，记录淫羊藿13个黄酮化合物的峰面积，计算相对标准偏差。峰面积RSD为1.28%～4.16%，结果表明该方法具有良好的精密度。

2.3.3 重现性试验

按照“1.5”供试品溶液制备方法，重复制备5份样品，按“1.3”色谱条件测定，记录淫羊藿13个黄酮化合物的峰面积和保留时间，计算相对标准偏差。峰面积RSD为0.35%～3.67%，保留时间RSD为0.014%～0.46%。结果表明该方法的重现性良好。

2.3.4 回收率试验

移液管吸取1 mg/mL 的样品1、1、2、2 mL于5、10、25、50 mL 容量瓶，用甲醇定容，即样品分别稀释了5、10、12.5、25 倍，再用移液管各取1mL分别与1 mL 的26μg/mL 的淫羊藿苷混溶，按“1.3”色谱条件测定，记录淫羊藿苷的峰面积和样品分析回收率，结果如表1所示。

表1 淫羊藿苷回收率测定结果Tab.1 The recovery rate of Icariin

2.3.5 各黄酮单体定量分析

取供试品溶液按“1.3”色谱条件连续进样4次，记录淫羊藿13个色谱峰的峰面积，代入线性回归方程，即可得到每个黄酮单体相当于淫羊藿甙的含量。结果如表2所示。

试验表明该淫羊藿提取物总黄酮质量浓度约为244.184μg/mL，淫羊藿溶液的质量浓度为1mg/mL，即淫羊藿提取物中以淫羊藿苷计的总黄酮质量分数为24.4%。

3 结论

（1）通过试验研究，建立了淫羊藿黄酮化合物HPLC分析方法。该方法分析时间短，样品分离度高，精密度、稳定性和重现性好，为淫羊藿水提物及其制剂的质量控制提供了依据。

（2）以HPLC-PDA 联用方法，确定这13 个峰都是淫羊藿黄酮化合物色谱峰。

（3）以淫羊藿苷为标准品，对这13个黄酮化合物进行了相对定量分析，结果显示提取物以淫羊藿苷计的总黄酮质量分数为样品总量的24.4%，该指标可作为控制淫羊藿水提物质量的参考。

表2 淫羊藿提取物中黄酮的质量浓度Tab.2 The content of Icariin in Epimedium extract μg·mL-1