脂肪酶产生菌的筛选及其耐甲醇驯化的研究

王 珊，孙 凤 麟，孙 玉 梅，陈 莉

（大连工业大学 生物与食品工程学院，辽宁 大连 116034）

0 引言

脂肪酶是一类在油-水界面上催化天然油脂（甘油三酯）降解为甘油和游离脂肪酸的酶。近年来它在食品生产、皮革加工、医药卫生、洗涤工业等方面都有着广泛的应用，已成为工业酶制剂中重要的生物催化剂之一［1-3］。

生物柴油是可再生并能生物降解的良好石油代替能源。生物法制备生物柴油较化学法具有反应条件温和、醇用量小、产物易收集、对环境污染小等优点，具有高催化效率和经济性［4］。在生物法制备生物柴油的反应体系中，减少甲醇对生物催化剂的毒害作用是提高生产效率的关键，为此，人们采取措施减少甲醇对生物催化剂的毒害作用，并进行了相关研究［5］。但在生物柴油催化剂的甲醇耐受性方面的研究，到目前为止，却还没有相关详细的报道。本研究通过维多利亚蓝指示剂透明圈筛选法，从土样中筛选到1株产脂肪酶活性较高的菌株FM-1，并对其进行了耐甲醇驯化。

1 实验

1.1 土样

土壤，大连工业大学校园内含油丰富的土壤。

1.2 培养基及组成

富集培养基（g/L）：（NH4）2SO40.1，KH2PO40.1，MgSO4·7H2O 0.2，FeSO4·7H2O 0.01，NaCl 0.5，吐温80 0.1，豆油2.0，自然pH 值，于1.03×105Pa灭菌30min［6］。

平板初筛培养基（g/L）：NaNO30.3，K2HPO40.1，KCl 0.05，MgSO4·7H2O 0.05，FeSO4·7H2O 0.01，吐温80 0.1，大豆油2.0，琼脂2.0，维多利亚蓝1 mg，用Na2CO3调pH 至8.0，于1.03×105Pa下灭菌30min。

复筛培养基（g/L）：蛋白胨1.0，FeSO4·7H2O 0.01，K2HPO40.1，KCl 0.05，KH2PO40.4，MgSO4·7H2O 0.05，大豆油2.0，吐温80 0.1，自然pH 值，于1.03×105Pa下灭菌30min［6］。

驯化培养基：在灭菌后复筛培养基中加入一定量的无菌甲醇。

斜面保藏培养基：察氏培养基。

1.3 脂肪酶产生菌的筛选

1.3.1 菌株的活化

取冰箱保存的菌株，接种于察氏培养基，于30 ℃活化培养48h。

1.3.2 种子液的制备向100mL 富集培养基中接入2 环菌丝，于28 ℃、130r/min摇床培养12h。

1.3.3 土样分离与富集培养

取1g含油丰富的土壤和9mL无菌生理盐水于试管中振荡混匀，静置12h，按2%接种量接于50mL的富集培养基中，于28 ℃、130r/min 摇床培养4d。按10%接种量重复富集培养3次。

1.3.4 初 筛

将富集培养液用无菌生理盐水稀释至合适的浓度，选10-5、10-6、10-73 个稀释度，每个稀释度取0.1mL菌液涂布于初筛平板上，于28 ℃静置培养72h。产脂肪酶的微生物菌落周围产生透明圈［7］，分离出透明圈与菌落直径的比值较大的菌株即为脂肪酶活性较高的菌株，经3次划线分离、纯化获得纯菌落。

生命周期费用是将项目的初投资、项目设计寿命内每一年的运行费，按照折现率折算成项目开始时的资金现值。生命周期费用的大小综合反映了项目初投资以及每年运行费的情况，生命周期费用越小，项目的经济性越好[10]。生命周期费用的计算如下：

1.3.5 复 筛

将初筛的菌株接种于100 mL 复筛培养基中，于28 ℃、130r/min摇床培养60h，测初筛菌株细胞内、细胞外的脂肪酶活性，选出产脂肪酶能力较高的菌株。

1.4 菌株FM-1的耐甲醇驯化

1.4.1 原始菌株FM-1的耐甲醇性

将5mL菌株FM-1种子液接入100mL甲醇质量浓度分别为1、3、5、7、9、11mg/L的驯化培养基中，于28℃、130r/min摇床培养60h，设原始菌的酶活为100%，测菌体中脂肪酶的相对活性。

1.4.2 菌株FM-1的耐甲醇驯化

驯化培养基中接入2～3 环菌株FM-1，于28 ℃、130r/min摇床培养60h，在同一甲醇质量浓度下驯化至脂肪酶活性稳定。菌种经过若干代驯化后，逐渐适应含有甲醇的环境，斜面保藏。

1.5 脂肪酶活力测定

脂肪酶活力定义：在最适反应条件下，以每分钟脂肪酶催化橄榄油水解产生1μmol脂肪酸的酶量为1个酶活单位（U）。

用铜皂比色法［8］测定脂肪酸量，每个样品测3组平行样。

2 结果与讨论

2.1 脂肪酶产生菌的筛选

从含油土样中分离出34株脂肪酶产生菌，在维多利亚蓝培养基上初筛出透明圈与菌落直径比值较大的6株菌。经复筛测得脂肪酶活力见图1。

图1 脂肪酶产生菌复筛结果Fig.1 Rescreen results of strains producing lipase

如图1所示，6 株脂肪酶产生菌的细胞内脂肪酶活力均高于发酵液中脂肪酶（即胞外脂肪酶）活力，均为胞内脂肪酶产生菌。在6株脂肪酶产生菌中，菌株FM-1的胞内酶活力明显高于其他菌株；大部分菌株在条件2下超声破碎细胞后测得的胞内酶活较条件1 高。因此，确定在条件2下超声破碎菌株FM-1细胞较好。

2.2 菌株FM-1的菌落形态

将优势菌株FM-1接种于平板中央，于30 ℃倒置培养4～7d。

由图2可知，菌落形成初期为白色，菌丝体生长迅速，很快铺盖平皿表面，菌落周围产生透明圈，说明产生脂肪酶。

2.3 菌株FM-1的耐甲醇驯化

2.3.1 原始菌株FM-1的耐甲醇性

将菌株FM-1接入不同甲醇质量浓度的驯化培养基中，测得胞内脂肪酶相对活力如表1所示，由表1可知，在不同甲醇质量浓度的驯化培养基中，菌株FM-1的胞内脂肪酶相对活力随培养基中甲醇质量浓度的升高而下降，表现出甲醇对胞内脂肪酶的抑制作用。

图2 菌株FM-1的平板菌落Fig.2 Colony morphology of strain FM-1on agar plate

表1 菌株FM-1在驯化培养基中的相对酶活Tab.1 Lipase relative activity of strain FM-1 in the acclimate media

2.3.2 菌株FM-1的耐甲醇驯化

菌株FM-1在不同甲醇质量浓度的驯化培养基中的耐甲醇驯化结果如图3所示。

图3 菌株FM-1在不同质量浓度甲醇培养基中的驯化结果Fig.3 Acclimation result of strain FM-1in media containing methanol at various concentration

由图3可知，菌株FM-1经反复驯化后，其对不同质量浓度甲醇的耐受性均有提高。在甲醇质量浓度为1 mg/L 的驯化培养基中驯化后，脂肪酶活性在每批次驯化中无明显提高，说明甲醇质量浓度为1mg/L的驯化培养基对菌体生长的影响和胞内脂肪酶的驯化的作用不明显。在甲醇质量浓度为3～7mg/L的驯化培养基中驯化后，菌株FM-1长势良好，胞内脂肪酶活力由65%～80%提高到82%～95%。在甲醇质量浓度为9mg/L的驯化培养基中驯化后，胞内脂肪酶活性没有显著提高。在甲醇质量浓度为11 mg/L 的驯化培养基中，菌株FM-1的胞内脂肪酶活力最低，经驯化后，酶活性有一定提高，其胞内脂肪酶相对活力为35%，较原始菌株有显著提高。可见，在一定甲醇质量浓度范围内，培养基中加入甲醇对提高细胞内酶的甲醇耐受性有一定的驯化作用，但甲醇质量浓度过高，不但无明显驯化作用，还会造成对细胞内酶的较大抑制作用，因此，不适合采用较高浓度甲醇的培养基进行耐甲醇驯化。

3 结论

在酶法制备生物柴油的反应体系中，减少甲醇对生物催化剂的毒害作用，是提高生产效率的关键。本实验从含油土样中对34株脂肪酶产生菌进行了分离，筛选出产脂肪酶活性较高的菌株；通过菌株的耐甲醇驯化，使活细胞对甲醇毒害的耐受性得以提高。研究表明，筛选出的产脂肪酶活性较高的菌株FM-1 的胞内脂肪酶活力为132U/g cell；通过反复驯化培养将菌株FM-1驯化成耐甲醇的优良菌株，在甲醇质量浓度为11mg/L的培养基中其脂肪酶相对活力为35%。