活性炭粒度与吸附条件对脂肪酶固定化的影响

杜 凯，孙 玉 梅，曹 方，王 珊，王 潇 磊

（大连工业大学 生物与食品工程学院，辽宁 大连 116034）

0 引言

脂肪酶（EC 3.1.1.3）是一类能催化酯类水解、合成或转酯化反应的酶类。由于其催化的酯合成和转酯化反应常在有机介质中进行，因此存在酶易结块、不易回收、很难重复利用等问题。固定化技术不仅解决了上述问题，而且提高了酶催化剂的稳定性和活力［1-3］。目前，对吸附固定化载体的研究主要集中在多孔和大孔材料上［4-6］，其中，活性炭颗粒具有无毒、强度好、价格低廉、固定化操作简单等特点，具有实际应用的价值。有报道以活性炭和硅胶颗粒为载体吸附固定化菠萝酶，在相同的条件下，干燥后的活性炭吸附酶相对活力为46.7%，是硅胶吸附酶相对活力的1.64倍［7］。王海雄等［8］以活性炭为载体，在pH 8.0的条件下吸附猪胰脂酶，未干燥的固定化酶活力与等量的游离酶相比提高了10%。本文以不同粒度的活性炭吸附固定脂肪酶，考察载体粒度和吸附条件对脂肪酶固定化的影响。

1 材料与方法

1.1 材 料

LVK-F100脂肪酶，12 000U/g，深圳市绿维康生物工程有限公司；20、40、60目活性炭，沈阳市 新 西 试 剂 厂；0.05 mol/L 磷酸缓冲液（K2HPO3-KH2PO3）；其他试剂均为分析纯。

1.2 方 法

1.2.1 活性炭颗粒的预处理

将一定量不同粒度活性炭颗粒分别置于1mol/L HCl溶液中，于50 ℃、100r/min 搅 拌1h后除去酸液，用去离子水反复冲洗至洗液pH为中性，然后置于130 ℃烘箱中烘干待用。

1.2.2 酶液的制备

分别取15g 酶粉溶于300 mL、不同pH（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）的磷酸缓冲液，于室温、300r/min搅拌2h后4 000r/min离心10min，上清液即为质量浓度0.1mg/mL 的酶液。再用与上清液pH 相同的磷酸缓冲液稀释上清液，制得不同pH 条件下质量浓度分别为0.01、0.03、0.05、0.07mg/mL的酶液。

1.2.3 时间及活性炭粒度对脂肪酶固定化的影响

分别将1g 不同粒度活性炭加入到30 mL 0.05mg/mL、pH 7.0 的酶液中，于30 ℃、150r/min振荡吸附1、2、3、4、5h 后，室温干燥24h。

1.2.4 酶液质量浓度对脂肪酶固定化的影响

分别将1g不同粒度活性炭加入30mL pH 7.0、不同质量浓度（0.01、0.03、0.05、0.07mg/mL）的酶液中，于30 ℃、150r/min 振荡吸附1h后，室温干燥24h。

1.2.5 酶液pH 值对脂肪酶固定化的影响

分别将1g 不同粒度活性炭加入30 mL 0.05mg/mL不同pH（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）的酶液中，于30 ℃、150r/min振荡吸附1h后，室温干燥24h。

1.2.6 温度对脂肪酶固定化的影响

分别将1g 不同粒度活性炭加入到30 mL 0.05mg/mL、pH 7.0 的酶液中，于不同温度（20、25、30、35、40 ℃）、150r/min 振荡吸附1h后，室温干燥24h。

1.2.7 蛋白含量测定

采用Bradford法［9］，使用牛血清蛋白为标准蛋白。

1.2.8 固定化酶活力测定

采用改进的橄榄油乳化法［10］。称取一定量的橄榄油和聚乙二醇，加入适量pH 7.0的磷酸缓冲液配制成乳化液，并于48 ℃预热5min后加入待测的固定化脂肪酶，于48 ℃恒温搅拌10min，用10mL 95%的乙醇终止反应。再以酚酞为指示剂，用0.025mol/L 的NaOH 滴定水解产生的脂肪酸。

酶活力定义：在上述反应条件下，每分钟水解产生1μmol脂肪酸所需的酶量为一个酶活单位（U）。

所有实验结果均为3次平行测定的平均值。

2 结果与讨论

2.1 活性炭粒度对脂肪酶固定化的影响

不同吸附时间内，不同粒度载体的吸附酶量及其固定化酶活力如图1、2所示。

图1 活性炭粒度和吸附时间对吸附酶量的影响Fig.1 Effect of particle sizes of carbon active and time on lipase adsorption

图2 活性炭粒度和吸附时间对固定化酶活力的影响Fig.2 Effect of particle sizes of carbon active and time on immobilized lipase activity

在吸附1h时，活性炭粒度越小其吸附酶量越大，不同粒度固定化酶表现出了较高且相近的酶活力。随着吸附时间的延长，不同粒度活性炭的吸附酶量均有少量增加，而固定化酶活力却呈下降趋势，这与Park 等［11］的研究现象与结果相同。Park等在研究硅胶颗粒对固定化酶催化脂肪酸甲酯化反应的影响时也发现，载体粒度越小，其比表面积越大；随着载体表面吸附酶量的增加，酶分子之间产生凝结作用的机会增多，易形成多层包被或皱褶结构。此结构形成的空间位阻，阻碍了底物与酶的接触，同时也阻碍了反应产物的扩散。

2.2 酶液质量浓度对脂肪酶固定化的影响

在改变酶液质量浓度的情况下吸附固定化脂肪酶，不同粒度载体的吸附酶量及其固定化酶的活力如图3、4所示。

图3 酶液质量浓度对吸附酶量的影响Fig.3 Effect of concentration of lipase solution on lipase adsorption

图4 酶液质量浓度对固定化酶活力的影响Fig.4 Effect of concentration of lipase solution on immobilized lipase activity

由图3、4可见，增大酶液质量浓度有利于载体吸附酶量的增加。在酶液质量浓度为0.05mg/mL时，不同粒度固定化酶的活力最大；当酶液质量浓度增大到0.07mg/mL 时，固定化酶活力明显下降。这是由于过高的酶液质量浓度使载体负载的酶量过大，脂肪酶分子在载体表面已形成多层包被或褶皱结构。此外，与其他粒度活性炭相比，40目活性炭的表面及孔径结构适中，使得固定化酶能在较宽的酶液质量浓度范围内表现出较好的活力。

2.3 酶液pH 对脂肪酶固定化的影响

在改变酶液pH 的情况下吸附固定化脂肪酶，不同粒度载体的吸附酶量及其固定化酶活力如图5、6所示。

图5 酶液pH 对吸附酶量的影响Fig.5 Effect of lipase solution pH on lipase adsorption

图6 酶液pH 对固定化酶活力的影响Fig.6 Effect of lipase solution pH on immobilized lipase activity

由图5、6可知，酶液pH 对不同粒度载体吸附酶量无显著影响，却对固定化酶活力影响显著。当pH 为7.0 时，固定化酶活力最高，与LVKF100游离脂肪酶的最适pH 相同。不同的酶液pH 会改变酶分子和载体的离子化状态，并且脂肪酶分子对pH 有“记忆”效应，即脂肪酶分子会“记忆”其吸附pH 下的离子化状态和分子构象。酶经过固定化后，离子化状态和分子结构不会因为反应体系pH 的变化而改变［12］。另外，固定化酶的干燥过程会使酶周围环境的pH 上升，使酶蛋白发生碱催化的β-消除反应，部分胱氨酸被降解导致酶部分失活。因此偏酸性酶液对固定化酶活力的影响较偏碱性酶液小［13］。

2.4 温度对脂肪酶固定化的影响

在改变吸附温度的情况下吸附固定化脂肪酶，不同粒度载体的吸附酶量及其固定化酶活力如图7、8所示。

图7 温度对吸附酶量的影响Fig.7 Effect of temperature on adsorption

图8 温度对固定化酶活力的影响Fig.8 Effect of temperature on immobilized lipase activity

温度的变化对活性炭吸附酶量无显著影响。在30 ℃时，3种固定化酶活力最高。温度影响脂肪酶分子的热运动，低温导致脂肪酶分子在活性炭表面分布效果差，影响底物与酶分子的结合与释放。温度过高则会破坏酶蛋白侧链的相互作用，从而破坏酶的空间构象，导致酶活力下降甚至失活［14］。

3 结论

固定化脂肪酶活力受载体吸附酶量和固定化后脂肪酶构象的影响。载体粒度和酶液质量浓度影响载体吸附酶量，载体粒度越小，比表面积越大、表面孔隙越多，能够提供的结合位点越多，而适当的酶液浓度能降低酶分子凝聚。酶液pH 和温度影响脂肪酶分子的空间构象，高温会破坏酶蛋白的侧链结构，pH 过高则会使酶蛋白发生碱催化的β-消除反应，导致酶部分失活。