基于AOTF-近红外光谱技术的复方丹参片快速无损质量控制研究

武卫红， 王 宁*， 石俊英， 董海平

(1.山东医学高等专科学校，山东济南250002;2.山东中医药大学，山东济南250355;3.济南金宏利实业有限公司，山东济南250100)

复方丹参片是防治心脑血管疾病常用中成药之一，2005版《中国药典》分别采用薄层层析法和HPLC法对其进行定性、定量分析，对控制复方丹参片的质量发挥了积极的作用，但因检测分析过程操作烦琐，无法实施现场无损快速分析，使得在线质量控制及流通领域中假劣药品的快速实验筛查难以进行。另外，在临床应用中发现，来自不同厂家的复方丹参片质量和疗效存在很大差异［1］，这不仅与指标成分的含量差异有关，而且也和制剂中总成分的数和量有密切关系，有专家提出亟待完善现行药典对复方丹参片的质量标准的问题［2］。因此，当前迫切需要一种快速、高效、适合现场检测的新型分析测试技术来完善复方丹参片的质量检测方法，进一步提高中成药的检测水平，加速中药的现代化进程。

近红外分析技术以其速度快、成本低、无损采样的特点，近年来已成功应用于药物分析领域［3-4］。“声光可调滤光器(AOTF)”-第五代近红外光谱仪因其具有便携、环境适应性强、可用于现场快速分析等优势在分析测试领域中已备受青睐［5］。国内，本研究团队率先将此技术引入药物分析领域中，获得较满意的研究结果［6-7］。本研究将AOTF-近红外光谱技术引入到复方丹参片的定性定量分析中，实现了对复方丹参片的无损快速定性检测和对丹酚酸B、丹参酮ⅡA、水浸出物、醇浸出物4项指标的同时、快速、无损定量分析。

1 材料与方法

1.1 仪器

美国BRIMROSE公司生产的Luminar 5030-731型便携式AOTF技术近红外光谱仪(主要部件:光学部分、电学控制部分、笔记本电脑;仪器波长范围1 100 nm～2 300 nm，波长增量2 nm，扫描次数300，采用InGaAs检测器)。挪威CAMO公司The Unscrambler分析软件。高效液相色谱仪(Anglient 1200、DAD 检测器)。

1.2 试药

复方丹参片 收集北京同仁堂制药厂、安徽华佗国药厂等56个厂家共215个批号，定性分析取166个批号为校正集，32个批号为验证集;定量分析取55个批号(来自5个大厂家)为样本，其中5个批号为验证集。

中成药对照品 咳喘宁、通宣理肺片、三黄片、金鸣片、双黄消炎片、消渴灵片、消炎片、抗骨增生片、小儿消食片、丹参片均购于济南药业集团。

丹酚酸B对照品(中国药品生物制品检定所，批号111562-200504供含量测定用);丹参酮ⅡA对照品(中国药品生物制品检定所，批号110766-200417供含量测定用)。

1.3 化学方法测定样本中丹参酮ⅡA、丹酚酸B、醇浸出物、水浸出物含量

按2005版《中国药典》［8］复方丹参片项下含量测定方法，采用HPLC法测定55个样品中丹参酮ⅡA和丹酚酸B含量。仪器方法学考察结果，丹参酮ⅡA精密度、稳定性、重复性RSD分别为0.22%，0.22%，0.99%，平均回收率 96.7%，RSD为1.02%;丹酚酸B精密度、稳定性、重复性RSD分别为2.58%，1.52%，1.25%，平均回收率96.6%，RSD为0.98%，均符合要求。每份样品重复测定3次，相对偏差小于1.5%。

依照2005版《中国药典》一部附录XA中水浸出物、醇浸出物测定法，分别检测55个样本，每份样品重复测定3次，相对偏差小于1.5%。

1.4 近红外光谱采集

取不同批号样品，将药片分别置于出光孔位置，于1 100～2 300 nm波长范围内进行漫反射扫描，波长增量2 nm，扫描平均次数为300次，每个批号样品扫描10片，得到166个样品的光谱图，见图1。

图1 复方丹参片NIR吸收光谱图Fig.1 Original NIR spectra of Compound Danshen Tablets

1.5 数据预处理与模型构建

对扫描得到的原始吸收光谱进行微分处理，可以消除基线漂移的影响，可分辨重叠峰，提高分辨率和灵敏度。但导数光谱法放大了相邻波长点差异的同时也可能导致噪声被放大，信噪比降低，经比较本研究采取一阶微分处理光谱数据。

原始光谱信号的平滑处理是消除噪声的常用方法，可有效平滑高频噪音，提高信噪比。本研究选择平滑数为9，可达到理想效果。

主成分回归分析法(PCA)是一种多元分析方法，被广泛应用在化学与测谱学分析中［9］，本研究利用该方法建立了片状复方丹参片的定性分析模型，并对验证集和对照品进行了验证。偏最小二乘法(PLS)，交叉-验证法(cross-validation)是 The Unscrambler定量分析软件主要的数学处理方法，其特点为利用全部光谱信息，将高度相关的波长点归于一个独立变量中，根据为数不多的独立变量建立回归方程，通过内部交叉检验防止过度拟合［10］。本研究采用该方法建立片状复方丹参片中4个参数的定量分析模型。

2 结果与讨论

2.1 定性分析

2.1.1 PCA定性模型

166个校正集复方丹参片样品的PC1、PC2主成分空间分布图见图2，图中无明显异常点，说明校正集样本在一定区域内呈较均匀的分布。

图2 校正集复方丹参片样品的PC1、PC2主成分空间分布图Fig.2 Score diagram of PC1 to PC2 of calibration set

2.1.2 定性分析模型验证复方丹参片验证集样品

调用定性模型，对验证集样品进行预测，结果见图3。软件以两种方法显示结果，一是以表格显示，二是模型区域判别显示。左侧表格中验证集样品编号后均有*号标记，说明它们属于模型内样品;模型区域图中，验证集样品均落在模型区域内(图中△号代表验证集样品，●号表示模型区域)，说明被检测的样品与建模样品相同，被定性分析模型认可。

两种显示方法均表明被检测的样品属于建模样品， 即是复方丹参片。

图3 定性模型对验证集验证结果Fig.3 Result of performance of qualitative model with Compound Danshen Tablets

2.1.3 定性分析模型验证中成药对照品

调用复方丹参片定性分析模型，验证中成药对照品，结果见图4。图中显示，对照品编号后均无*号标记，说明10种中成药均可被模型有效排除;模型区域图中，对照品均没有落在模型区域内，说明被检测样品与建模样品不相同，即不是复方丹参片。

图4 定性模型对中成药对照品的验证结果Fig.4 Result of performance of qualitative model with reference substance

以上结果表明，AOTF-近红外光谱技术建立的复方丹参片片状定性分析模型可对验证集、对照品进行准确识别，因此，在实际工作中可直接对复方丹参片(薄膜衣)进行快速定性分析，本研究实现了对复方丹参片样品的无损直接定性鉴别，为生产中无损快速检测和商品流通中的打假工作提供了一种新的分析方法。

2.2 定量分析

2.2.1 PLS1数学模型

将经过预处理后的光谱数据与HPLC分析数据进行关联，用The Unscrambler定量分析软件采用PLS法，交叉-验证法建立模型。NIR和HPLC测定的异常值分别采用光谱影响值Leverage和化学值误差Residual两个统计量来检验剔除，并根据NIR数学模型的主要参数内部交叉验证决定系数(R2CV)、内部交叉验证均方差(RMSECV)、外部验证决定系数(R2Cal)、外部验证均方差(RMSEP)确定最优模型。复方丹参片中丹参酮ⅡA、丹酚酸B、醇浸出物、水浸出物PLS1数学回归模型参数见表1，表中参数显示4个模型较为理想。

表1 PLS1数学回归模型参数Tab.1 PLS1 regression model parameters

2.2.2 检测模型效果

以PLS1建立的校正模型对5份外部验证集样品进行预测，再对预测值与化学值进行相关分析和显著性t检验，结果见表2。从预测值与化学值之间的相关性看，醇浸出物的r值最好(0.898)，水浸出物r值最差(0.657)，但t显著性检验表明丹参酮ⅡA、丹酚酸B、醇浸出物、水浸出物4个参数预测值与化学值之间差异并不显著。

表2 PLS1回归模型的验证结果Tab.2 Results of prediction for external validation set by PLS1 regression model

2.2.3 精密度实验

取1个预测样品，重复扫描20次，将所得光谱带入建立的校正模型计算含量，以考察方法的精密度，结果丹参酮ⅡA、丹酚酸B、醇浸出物、水浸出物的RSD值分别为3.62%，4.75%，2.22%，2.14%，说明仪器精密度良好。

2.2.4 稳定性实验

取1个预测样品，每1 h扫描1次，于5 h内重复扫描5次，考察样品的稳定性。丹参酮ⅡA、丹酚酸B、醇浸出物、水浸出物的RSD值分别为1.73%，2.08%，3.32%，1.32%，，说明样品在5 h内相对稳定。

以上结果表明，AOTF-NIR技术可以直接对复方丹参片进行扫描，建立4个指标的定量分析模型，不仅提高了效率，而且实现了对复方丹参片的无损定量分析。

3 结论

本研究在2005版《中国药典》复方丹参片单纯以指标成分为标准的基础上，加强了对总成分的检测，建立了复方丹参片中4个指标的同时快速定量分析方法。该方法更加符合中医药特点，既客观反映了中药内在物质基础，又在宏观上有效控制了中药整体质量，使复方丹参片的质量控制更全面、更科学。

研究中采用Luminar 5030-731型便携式声光可调滤光器(AOTF)-近红外(NIR)光谱仪，结合化学计量学方法，对复方丹参片直接扫描获取光谱信息，分别建立定性定量分析模型，实现了对复方丹参片样品的无损、直接快速分析，同时为其他中成药的在线质量控制和适时快速质量评价提供了新思路。

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