博落回中生物碱对5种皮癣真菌抑制作用的初步研究

田 晶， 郁建平， 葛永辉， 齐柳娅， 李春梅

(贵州大学生命科学学院，贵州贵阳550025)

红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)，许兰黄癣菌(Trichophyton schoenleini)，玫瑰色癣菌(Trichophyton rosaceum)，须癣毛癣菌(Trichophyton mentagrophytes)，絮状表皮癣菌(Epidermophyton floccosum)是人源的皮肤癣菌，能引起常见的皮肤浅部真菌，如手癣、足癣、头癣等。目前常见的治疗皮肤真菌的主要有酮康唑，伊曲康唑等化学用药，虽然在抑制皮癣真菌有一定的作用，但对于真菌病却不能起到很好的根治作用。因此，筛选植物中有抗真菌活性的成分，具有一定的研究意义。博落回(Macleaya Cordata(Willd)R.Br)是罂粟科博落回属(Macleaya R.Br)植物，研究表明，博落回中含有丰富的生物碱并具有重要的药理活性［1，2］。目前对于博落回的研究主要集中在提取纯化工艺以及药理作用方面，在农药以及兽药方面有一定的应用［3］。民间有以博落回全草入药，主治恶疮及皮肤病［4］。本研究对博落回生物碱的抗皮癣真菌活性进行测定，目的在于对开发博落回应用于皮肤用药方面提供理论依据。

1 材料

1.1 实验供试菌种 红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)、许兰黄癣菌(Trichophyton schoenleini)、玫瑰色癣菌(Trichophyton rosaceum)、须癣毛癣菌(Trichophyton mentagrophytes)、絮状表皮癣菌(Epidermophyton floccosum)均购自中国医学科学院皮肤病研究所。

1.2 实验药品 博落回生物碱，自制，含量约为70%，盐酸血根碱纯品(sigma公司)，白屈菜碱纯品(sigma公司)，复方酮康唑软膏(7 g):(批号:090321，广东顺峰药业有限公司)。

2 方法

2.1 博落回生物碱的制备 取博落回全草，粉碎，室温下用0.5% 盐酸渗漉，合并渗漉液，调节pH约为3，通过预先处理好的强酸型阳离子树脂，上柱，洗脱，浓缩，得到博落回生物碱，样品为淡黄色粉末，生物碱含量约为70%。

2.2 培养基的制备 采用沙氏培养基:蛋白胨10 g，琼脂 20 g，葡萄糖 40 g，蒸馏水 1 000 mL，121 ℃灭菌30 min，未调pH。其它:水琼脂:琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL;0.1% 吐温-80生理盐水。

2.3 待测物的配置 抑菌试验配置50 mg/mL的博落回生物碱溶液，10 mg/mL的血根碱盐酸盐溶液以及10 mg/mL的白屈菜碱溶液。抑制率实验将博落回生物碱配制成 20、10、5、4、3 mg/mL 的溶液各25 mL。最低抑菌浓度实验将博落回生物碱配制成48、24、12、6、3 mg/mL 的溶液各 10 mL。溶剂为40%二甲基甲酰胺溶液。

2.4 菌悬液的制备 将试管斜面的菌种接种于平板中，28～30℃培养7 d，活化菌种。将已活化的菌种接种于试管斜面内，28～30℃培养7 d。用0.1%吐温生理盐水洗孢子，调节孢子悬液在低倍镜下(15×10倍)下每视野80～100个左右孢子。

2.5 抑菌实验 制备双层培养基，采用琼脂打孔法［5］。将已灭菌的水琼脂10 mL熔化后趁热倒入9 cm直径的培养皿中。待水琼脂凝固后，将已融化的10 mL沙氏培养基冷至约50℃左右，迅速吸取1 mL菌液加入培养基内，充分混匀后，倒入已凝固的水琼脂上。每种菌液各制作3个含菌琼脂平板，待充分凝固后，用灭菌的打孔器在每个琼脂平板上打3个孔，第一种琼脂平板中的孔中分别加入40μL博落回生物碱溶液、阳性药液、空白溶液;第二种中加入盐酸血根碱溶液、阳性药液、空白溶液;第三种中加入白屈菜碱溶液、阳性药液、空白溶液，置28℃培养箱中培养一周。重复4次，测量抑菌圈。

2.6 抑制率测定 平板稀释法［5］，将已经配制好的博落回生物碱溶液，浓度分别为 20、10、5、4、3 mg/mL，各吸取2 mL于灭菌的三角瓶中，加入13 mL灭菌后并冷却至50℃左右的培养基，立即摇匀倒入培养皿内凝固。最终培养基内的博落回生物碱溶液的浓度分别为 2.67、1.33、0.67、0.53、0.4 mg/mL。另外，吸取2 mL 40% 二甲基甲酰胺溶液置于已灭菌的三角瓶中，加入13 mL灭菌并冷却的培养基，倒入培养皿中做空白对照。用打孔器分别在5种供试菌中生长旺盛的菌落边缘打取直径为0.5 cm的菌圆片，移至含药液的琼脂平板中央，置28℃培养箱中培养一周。重复4次。7 d后观察菌落直径，取平均值，计算平均抑菌率。按下式计算抑菌率:菌落直径(mm)=测量菌落直径－5(mm)，抑菌率(%)=(对照菌落直径－处理菌落直径)/对照菌落直径×100%。

2.7 最低抑菌浓度(MIC)值的测定 固体培养基稀释法［5］，将48 mg/mL的博落回生物碱溶液用灭菌蒸馏水分别稀释成 24、12、6、3 mg/mL的药液。分别取每种浓度的药液1 mL，加入14 mL灭菌并冷却至60℃的沙氏培养基，立即摇匀倒入培养皿内凝固。博落回生物碱的终浓度分别为3.2、1.6、0.8、0.4、0.2 mg/mL。另外，吸取1 mL 40% 二甲基甲酰胺溶液，加入14 mL灭菌并冷却的培养基，倒入培养皿中做空白对照。用接种环蘸取供试菌液在已凝固好的培养基上进行划线培养，置28℃培养箱中培养7 d。重复4次，观察结果。

3 结果

3.1 博落回生物碱、血根碱、白屈菜碱抑菌比较结果显示:血根碱对除了对须癣毛癣菌无抑制作用，对红色毛癣菌的抑制作用相对较差外，对许兰黄癣菌、玫瑰色癣菌、絮状表皮癣菌，均有良好的抑制效果，其中尤其对玫瑰色癣菌的抑制效果明显。白屈菜碱对红色毛癣菌以及玫瑰色癣菌无明显抑制作用，对许兰黄癣菌、絮状表皮癣菌、须癣毛癣菌均有一定的抑制作用，且效力相当。博落回总生物碱对于5种皮癣真菌均有抑菌效果。具体结果见表1。

表1 博落回生物碱，血根碱盐酸盐，白屈菜碱对5种皮肤癣菌抑菌效果(抑菌圈直径:mm，±s，n=4)Tab.1 The anti-fungus activaties of the compounds from Macleaya cordata

表1 博落回生物碱，血根碱盐酸盐，白屈菜碱对5种皮肤癣菌抑菌效果(抑菌圈直径:mm，±s，n=4)Tab.1 The anti-fungus activaties of the compounds from Macleaya cordata

注:Tru:红色毛癣菌，Ts:许兰黄癣菌，Tro:玫瑰色癣菌，Ep:絮状表皮癣菌，Tm:须癣毛癣菌。/表示无明显的抑菌圈。

待测物 试验菌种Tru Ts Tro Ep Tm博落回生物碱12±2.4 9±1.4 25±1.6 18±2.2 15±1.4血根碱 5±0.8 13±0.8 30±2.7 15±1.6 /白屈菜碱 / 18±1.4 / 11±1.8 10±0.8复方酮康唑10±1.4 11±2.2 23±2.8 20±1.6 13±1.8

3.2 不同浓度博落回生物碱对5种皮癣真菌生长的抑制作用比较 结果显示:在博落回生物碱浓度分别为2.67mg/mL及1.33mg/mL时，对红色毛癣菌、许兰黄癣菌、絮状表皮癣菌、玫瑰色癣菌、须癣毛癣菌的抑制率均达到100%，抑菌效果显著。当浓度为0.67 mg/mL时，博落回生物碱对这5种生物碱的抑制率均在70%以上，对玫瑰色癣菌的抑制率达到90%以上。但在浓度为0.4 mg/mL时，对于絮状表皮癣菌的抑制率低于30%，相对其它真菌的抑制率而言，其抑菌效果较差。具体结果见表2。

表2 博落回生物碱对5种真菌的抑制率(±s，n=4)Tab.2 The inhibition rate of 5 kinds of skin fungus by M acleaya alkaloids

表2 博落回生物碱对5种真菌的抑制率(±s，n=4)Tab.2 The inhibition rate of 5 kinds of skin fungus by M acleaya alkaloids

注:表内数字为抑制率(%)，—表示没有真菌生长，抑制率为100%。

供试菌种博落回生物碱2.67 mg/mL 1.33 mg/mL 0.67 mg/mL 0.53 mg/mL 0.4 mg/mL Tru— —70.6±1.4 64.7±3.4 62.4±1.9 Ts — — 71.0±2.5 64.5±2.0 58.1±1.5 Ep — — 72.2±2.9 44.4±2.3 27.8±1.4 Tro — — 91.1±1.9 78.1±3.4 75.0±3.4 Tm— —86.7±3.1 83.3±2.3 76.7±2.8

3.3 博落回生物碱的最低抑菌浓度(MIC)测定结果显示:博落回生物总碱对红色毛癣菌、许兰黄癣菌以及絮状表皮癣菌的最低抑菌浓度均为1.6 mg/mL，对玫瑰色癣菌、须癣毛癣菌的最低抑菌浓度为0.8 mg/mL。由结果可知，博落回生物碱作为植物源天然抗真菌剂，效果明显。空白组的结果为真菌大量生长，说明博落回生物碱的的抗菌活性较好。具体结果见表3。

表3 博落回生物碱最低抑菌浓度(M IC)值(x=Σxi/n，n=4)Tab.3 The M IC test for 5 kinds of skin fungus by M acleaya alkaloids

4 讨论

研究结果表明，博落回生物碱具有显著的抑制皮癣真菌的作用，而博落回生物碱中的血根碱和白屈菜碱虽然也有一定的抑制皮癣真菌的作用，但其总体效果不及博落回生物碱。博落回在全国广泛分布，资源容易获得，其所含的生物碱也较容易提取。民间已将博落回酊剂用来治疗手足癣。我们可以利用博落回丰富的资源，针对其对皮癣真菌良好的活性，将博落回生物碱开发利用为治疗皮肤病的剂型，这将具有广阔的市场前景和意义。

［1］胡之壁，徐 垠，冯胜初，等.博落回果实中有效成分的研究［J］. 药学学报，1979，14(9):53.

［2］高尾樽雄，安本幸.罂粟科植物博落回生物碱的研究［J］.药学杂志(日)，1973，93:242.

［3］周顺玉.博落回浸提物对茶毛虫、茶尺蠖的生物活性［J］.安徽农业科学，2007，35(5):1408.

［4］宋有林.博落回酊剂治疗手足股癣30例［J］.中医外治杂志，2000，5:41.

［5］周立刚.植物抗菌化合物［M］.北京:中国农业科技出版社，第一版，2005:10.

［6］郑钧镛.药品微生物学及检测技术［M］.北京:人民卫生出版社，1989.