水飞蓟有效成分的提取研究

董 岩， 孔春燕

(德州学院化学系，山东德州253023)

水飞蓟(Silybum marianum L.Gaertn)是菊科水飞蓟，属草本植物，原产于南欧、北非［1］。是欧洲民间的一种草药，用于治疗肝胆疾病。我国早在20世纪50年代初就引入了水飞蓟，但仅用于观赏，直到20世纪60年代末以H.Wagner为代表的德国药学家，对其有效成分进行提取后，我国才将它作为一种保肝药用植物推广种植。

水飞蓟素具有保肝、降血脂、抗氧化、防止糖尿病、保护心肌、抗血小板聚集和抗肿瘤等生理作用［2-10］。水飞蓟素保肝作用的机制可归结为对肝细胞膜的保护作用［2］、促进肝细胞的修复［3］、再生功能和抗肝纤维化作用［4-5］;可以显著降低外源性高脂血症的胆固醇和甘油三酯［6］;康一凡证明水飞蓟宾具有明显的减轻脂质过氧化损害的作用［7］;而Huseini等证实糖尿病病人每天服用SM 200 mg后，患者血糖明显降低［8］;陈红等实验证明水飞蓟宾可以减轻缺氧、缺糖的心肌细胞的损伤，并可部分对抗异丙肾上腺素加重缺氧、缺糖心肌细胞的损伤作用［9］;另外有研究表明水飞蓟素能明显降低血小板黏附率［10］。

本文采用有机溶剂冷渍法、有机溶剂热回流法和有机溶剂连续回流多次回收法对水飞蓟有效成分进行提取，通过对三种方法实验过程所得到的水飞蓟有效成分的提取率进行比较，探讨水飞蓟总黄酮和水飞蓟宾精制的最佳实验方法。

实验部分

1 仪器与试剂

岛津UV-2450 PC紫外-可见分光光度计(日本岛津公司);Nicolet IR 200傅立叶红外光谱仪(美国Thermo Nicolet公司);DF-Ⅱ集热式恒温水浴磁力加热搅拌器(江苏省金坛市医疗仪器厂);AL204 Mettler Toledo电子天平(瑞士Mettler Toledo公司);(X-4型数字显示显微熔点测定仪，北京泰克仪器有限公司)。

甲醇、无水乙醇、丙酮、石油醚、乙酸乙酯、正己烷、2，4-二硝基苯肼、氢氧化钾、浓硫酸、氢氧化钠均为分析纯试剂，水飞蓟种子(烟台只楚药业有限公司);

2 有机溶剂冷渍法提取水飞蓟有效成分［11］

将干燥的水飞蓟种子粉碎，过40目筛，用正己烷脱脂6 h左右，至脱尽为止。取10 g脱脂种子粉末，用无水乙醇在室温下浸提3次，第1次用80 mL，第2次用50 mL，第3次用20 mL，每次浸提20 h。合并3次浸提液，减压蒸馏回收乙醇，得黄色粉末状物质，加甲醇溶解，放置2 d后抽滤，取不溶物真空干燥，按5项所示方法测定水飞蓟总黄酮含量，以mg/g脱脂种子表示。将浸提时间改为24 h(×3)，28 h(×3)，其余按上述操作进行。用同样的步骤以甲醇和丙酮代替乙醇作为溶剂进行提取。

用乙醇做溶剂，取10 g未脱脂种子按上述操作进行提取，结果以mg/g未脱脂种子表示。实验结果见图1，图2。

图1 不同溶剂提取脱脂种子中水飞蓟总黄酮结果比较(冷浸法)

3 有机溶剂热回流法提取水飞蓟有效成分［12］

称取10 g脱脂种子粉末9份，置于150 mL无水乙醇中，水浴加热使乙醇沸腾，开始计时，每30 min取一份样品稍冷过滤，减压蒸馏回收乙醇，得黄色粉末状物质，加甲醇溶解，静置2 d后抽滤，将所得产品干燥，按5项所示方法测定水飞蓟总黄酮含量，以mg/g脱脂种子表示，测定9次。用同样的步骤以甲醇和丙酮代替乙醇作为溶剂进行提取。

用乙醇做溶剂，取10 g未脱脂种子按上述操作进行提取，结果以mg/g未脱脂种子表示。实验结果见图3，图4。

图2 乙醇提取脱脂和未脱脂种子中水飞蓟总黄酮结果比较(冷浸法)

图3 不同溶剂提取脱脂种子中水飞蓟总黄酮结果比较(有机溶剂热回流法)

图4 乙醇提取脱脂和未脱脂种子中水飞蓟总黄酮结果比较(有机溶剂热回流法)

4 有机溶剂连续回流多次回收法提取水飞蓟素有效成分

取10 g脱脂种子粉末，用无水乙醇60 mL按索式法连续抽提总黄酮，从第1次虹吸开始计时，每80 min倒出烧瓶中收集的抽提液，并换新的乙醇继续抽提，连续抽提3次，合并3次抽提液，减压蒸馏回收乙醇，得黄色粉末状物质，加甲醇溶解，静置2 d后抽滤，将所得产品干燥，按5项所示方法测定水飞蓟总黄酮含量，以mg/g脱脂种子表示。将抽提时间改为60 min(×4)，40 min(×6)，其余按上述操作进行。分别用甲醇和丙酮代替提取溶剂乙醇，按以上操作进行提取。

5 水飞蓟总黄酮的含量测定

水飞蓟总黄酮的含量测定采用紫外吸收法［13］。

准确称取提取到的样品0.15 g完全溶解于约20 mL甲醇中并倒入25 mL量瓶，稀释到刻度，摇匀。用移液管吸取1.0 mL该溶液到10 mL量瓶中，另外准备1.0 mL的甲醇作空白。分别向上述样品溶液和空白甲醇中加入2 mL新鲜配制的2，4-二硝基苯肼溶液(将0.500 0 g的2，4-二硝基苯肼溶解在1 mL浓硫酸中，用甲醇稀释到50 mL)，摇匀后，在50～55℃的水溶液中加热反应50 min。待以上两溶液冷却下来后用氢氧化钾甲醇溶液(2.5 g氢氧化钾溶解在7.5 mL水中，用甲醇稀释到25.0 mL)稀释到10 mL，充分混合。2 min后，将此混合溶液移取1 mL至50 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，充分摇匀，放置1 d后，用0.45μm滤膜过滤。

将已过滤的溶液在490 nm波长下(1 cm厚测量池)测量其的吸光度，用空白溶液做参考，取537为水飞蓟宾2，4-二硝基苯肼衍生物的消光值E(1%，1 cm)时，按下列公式计算以水飞蓟宾表示的黄酮类化合物的质量分数:

6 水飞蓟宾的精制及鉴定

6.1 柱层析分离洗脱剂的选择2 mg水飞蓟素溶于少量乙醇，硅胶板点样，分别用乙酸乙酯-甲醇(20∶1)、乙酸乙酯-石油醚(2∶1)展开，通过薄层色谱研究发现，最佳的展开剂为乙酸乙酯-石油醚(2∶1)，其中Rf=0.42。

6.2 柱层析分离水飞蓟宾

将300～400目硅胶用石油醚搅拌均匀，用加料漏斗倒入硅胶柱中，压实;将4 g水飞蓟素粉溶于甲醇溶液中，加入干硅胶，搅拌均匀后，将溶剂甲醇旋干。将得到的干燥硅胶倒入已装好的硅胶柱中，用乙酸乙酯-石油醚(2∶1)进行柱分离。整个柱分离过程用薄层色谱跟踪。将合适试管中的展开剂旋干，干燥，得到白色粉末状固体。

6.3 水飞蓟宾的精制

水飞蓟宾的精制常采用重结晶的方法［14］。

取4.0 g飞蓟素，量取30 mL甲醇倒入烧杯中，加热溶解，滤去不溶物，室温放置2 d后抽滤，固体用少量甲醇洗3次，再用少量石油醚洗3次，减压抽干，干燥后称量所得产品的质量。母液再在室温下放置3 d后抽滤，干燥后称量所得产品的质量，两次获得的即是水飞蓟宾粗品(白色微黄色松散颗粒)，计算其产率。分别用乙醇和丙酮代替甲醇按以上步骤进行提取，并计算水飞蓟宾的产率。所得结果列表1。

表1 重结晶方法精制水飞蓟宾的结果

6.4 水飞蓟宾的鉴定

分别取结晶物甲醇溶液1.0 m L，加少许镁粉，振摇后，滴数滴浓盐酸，在1～2 min内呈现玫瑰红色［15］;滴加氢氧化钠溶液2滴，呈现深黄色［12］;滴加浓硫酸4～6滴，立即呈现暗红色。三种显色反应均为阳性反应，初步确定所得产品为水飞蓟宾晶体。

状态:白色粉末，熔点:151～152℃。(X-4型数字显示显微熔点测定仪)

用岛津UV-2450 PC紫外-分光光度计进行紫外扫描，确定其最大吸收峰对应波长。经过测定可以得出，最大吸收峰位于287 nm，肩峰位于322 nm。与文献报道结果一致［16］。

KBr压片，用Nicolet IR 200傅立叶变换红外光谱仪进行扫描，测定分子中有关官能团的吸收峰及频率值。经过测定可以得出:3 454，2 925，1 638，1 510，1 468，1 435，1 366，1 272，1 166，1 083，1 034，1 019，966，824 cm－1处有峰。与文献报道结果一致［16］。

结果讨论

通过对有机溶剂冷渍法、有机溶剂热回流法和有机溶剂连续回流多次回收法提取水飞蓟总黄酮的比较，可以发现冷渍法最大的好处是不需要加热，可以节约资源，降低生产成本，但耗时较长，生产效率较低;热回流法能大大加快提取速率，会消耗大量的能源，生产成本较高;而最好的方法则是连续回流多次回收法，与冷渍法和热回流法相比较，这种方法使水飞蓟总黄酮提取率明显的提高了，同时此法由于减少了溶剂的相对使用量，从而比单纯的热回流法节约了部分能耗，降低了成本。

另外，通过比较3种溶剂可以看出，以乙醇作溶剂时，所得水飞蓟总黄酮提取率最高，而丙酮和甲醇相差不大。还有，通过比较同一溶剂对脱脂种子和未脱脂种子提取率的高低可知，脱脂种子中水飞蓟总黄酮较易提取。

水飞蓟宾的精制实验结果表明，丙酮产率最低，甲醇、乙醇两种溶剂最终产率相差不是很大，考虑甲醇的毒性、成本等因素，我们选用乙醇作重结晶溶剂。

本次实验与传统实验相比有两个方面的突破点。其一就是连续回流多次回收法的应用，与普通热回流法相比，这种方法使水飞蓟总黄酮提取率明显的提高了，同时此法由于减少了溶剂的相对使用量，从而比单纯的热回流法节约了部分能耗，对工业生产降低成本具有重要意义;其二在于水飞蓟宾精制方法的改进，水飞蓟宾在精制过程中传统的脱色方法是采用活性炭吸附，本实验中为了提高水飞蓟宾的得率，不采用活性炭，而是经过多次重结晶使其达到较高纯度，这种方法对工业生产中提高产率具有一定帮助。

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