人肠道病毒71型亚单位疫苗的研制

郝 翊，秦 川

(北京协和医学院 中国医学科学院实验动物研究所 卫生部人类疾病比较医学重点实验室，北京 100021)

人肠道病毒71型亚单位疫苗的研制

郝 翊，秦 川

(北京协和医学院 中国医学科学院实验动物研究所 卫生部人类疾病比较医学重点实验室，北京 100021)

目的 利用原核表达技术制备人肠道病毒71型(EV71)的亚单位融合疫苗，并通过小鼠模型对其保护效果进行评价。方法 在大肠杆菌中融合表达EV71的亚单位肽段，随后将肽段免疫雌鼠，对其交配后产下的幼鼠进行病毒感染，通过检测其组织内的病毒拷贝数和病理变化，对疫苗的保护效果进行评价。结果 通过肽段融合的方法，得到五种备选疫苗，分别为VacA，VacB，VacC，VacD和VacE，这五种疫苗均具有一定的体外保护能力，并且VacB和VacC与正常人大脑组织无明显交叉反应。动物模型评价结果显示，VacB和VacE能赋予幼鼠抗病毒感染的保护效果。结论 利用EV71的小鼠感染模型评价了针对EV71的亚单位联合疫苗，VacB和VacE的保护效果较好，此外，VacB与人脑组织间无明显交叉反应，可以作为潜在的无神经毒性的临床使用疫苗。

人肠道病毒71型;融合亚单位疫苗;小鼠

人类肠道病毒 71型(human enterovirus 71，EV71)是手足口病的病原体之一，具有嗜皮肤性和嗜神经性，较之脊髓灰质炎病毒具有更广泛的神经毒性。该病毒主要感染5岁以下儿童，导致手足口病及疱疹性咽峡炎，少数情况下引起的并发症包括脑膜炎、无力性麻痹、肺水肿、肺出血等，严重病例可导致死亡［1，2］。EV71 基因组全长 7413 bp，编码2193个氨基酸。主要有 P1，P2和 P3三种蛋白，P1蛋白可被蛋白酶切割为VP1，VP2，VP3和VP4，为组成病毒粒子的结构蛋白，而P2与P3则被切割为有活性的功能蛋白，负责病毒RNA的复制与蛋白组装［3］。VP1蛋白被认为是主要的抗原决定位点集中区域，曾被多次报道用来研制病毒疫苗［4］。1975年在保加利亚发生超过750例以婴幼儿发病为主的EV71感染，无手足口病症状，只出现中枢神经系统症状的群体发病，其中报告无菌型脑膜炎545例、类脊灰样麻痹52例、脑干脑炎68例(死亡44例)［5］。与EV71感染有关的神经系统表现因小脑、脑干和间脑等受累部位不同而各具特点。神经源性肺水肿病死率高，是EV71感染的重要并发症和主要死因，多由手足口病和疱疹性咽峡炎进展而来，并呈现中枢神经受累症状，如肢无力、肢感觉迟钝和癫痫发作等，同时伴有轻微的交感神经紧张症状，如失眠、多汗和麻痹性肠梗阻等［6］。

我国1981年首次在上海发现本病，随后北京、河北、天津、福建、吉林、山东、湖北、广东等十几个省(市)均有报道［6］。从2009年年初到 4月 7号，网络直报显示，全国累计报告手足口病例115618例，其中重症773例，死亡50例。从1999年至2008年，分离自深圳、上海、重庆、山东临沂和阜阳市的EV71病毒均为 C4亚型，对其基因组序列分析表明，各分离株具有很高同源性，表明肠道病毒 EV71没有发生明显变异。

目前EV71感染尚无有效的治疗药物。因此，尽快研制出安全有效的病毒疫苗，无疑是防止EV71传播的有效手段之一。

本文采用融合的亚单位疫苗策略，分别选择EV71多肽链中三个肽段区域进行融合的实验和研究，构建出5种融合亚单位备选疫苗;并利用 EV71小鼠模型，对该疫苗的保护效果分别作出评价。

1 材料和方法

1.1 实验菌株、动物

EV71毒株 Fuyang-0805，由中国疾病控制中心赠送，培养于人横纹肌瘤细胞(RD)上，培养基为含10%胎牛血清(FBS)的 DMEM［5］。SPF级 ICR小鼠，6周龄，雌性。购于维通利华公司(合格号:0030794)。

1.2 主要试剂

Qiagen试剂盒，ReverTra-Plus试剂盒均购自Invitrogen公司;Ni-HTA购自Novagen公司;辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG，DAB染色试剂盒均购自中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 病毒分离纯化:将已经病变的RD细胞冻融3次，离心5000 g×20 min，除去细胞碎片，上清离心80000 g×3 h，病毒沉淀悬浮在DMEM培养基中。EV71灭活条件为56℃，30 min。

1.3.2 融合亚单位蛋白表达与纯化:融合表达的亚单位蛋白共分为5种，每种蛋白分别包含3个肽段，每两个肽段之间用相应的蛋白 Linker连接。其中第一个与第二个肽段间用 Linker1连接，序列为:EASPPGE，第二个与第三个肽段间用Linker2连接，序列为:G4S。详见引物序列(表1)。PCR扩增、酶切、连接等分子生物学操作，均按照分子克隆进行。先将目的基因克隆到 pET28a(+)载体中，转化至E.coli DH5α感受态细胞中，蛋白表达在E.coli BL21(DE3)中进行。携带表达质粒的菌株在含有50 μg/mL卡那霉素的 LB培养基中培养，当 A600达到0.6时，加入终浓度为0.2mmol/L的 IPTG，继续在室温(25℃)下培养8 h。收获的菌体用超声波破碎后，提取其中的包涵体，洗涤完全的包涵体用8 mol/L尿素溶解，再用Ni-HTA进行亲和层析纯化，纯化后的蛋白透析到0.9%的生理盐水中，蛋白浓度测定使用 Bradford方法［6］，其纯度用 SDS-PAGE 来检测。

1.3.3 纯化蛋白免疫小鼠:作为备选疫苗的各重组蛋白首次免疫时，与等体积弗氏完全佐剂混合，剂量为50 μg/只，免疫方式为腹腔注射;初次免疫 3周后进行第二次免疫，各重组蛋白与等体积的弗氏不完全佐剂混合，剂量与第一次相同。一周后，雌鼠进行交配。EV71的免疫剂量为 107TCID50/只。阴性对照组抗原获得方式为:将未转入表达载体的大肠杆菌裂解上清。

1.3.4 间接ELISA方法检测免疫小鼠血清抗体效价:在96孔板中，将各重组蛋白进行包被，每孔蛋白剂量为1 μg，4℃。过夜后，用含 3%BSA的 PBST封闭;随后加入梯度稀释的抗血清，37℃静置1 h。PBST洗涤3次，加入10000倍稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠的二抗，37℃静置1 h。PBST洗3次后，加入 TMB底物显色，使用2 mol/L的H2SO4终止反应，在450 nm与630 nm处，双波长读取数据，以大于阴性血清数值2.1倍的最低稀释度作为抗血清的效价。

表1 构建融合蛋白表达基因的引物序列Tab.1 Primers used for constructing fusion genes for antigens expression

1.3.5 病毒中和试验测定免疫血清中和指数:病毒中和试验使用RD细胞作为受体细胞，将RD细胞以2×104/孔的浓度接种入96孔板，37℃中培养过夜。抗血清经过56℃处理30 min，以灭活补体成分。抗血清和病毒的稀释，使用含 2%FBS的DMEM培养基，抗血清以2倍的梯度稀释，分别与等体积的200TCID50的EV71混合，37℃中温育1 h;随后将混合液加入细胞孔内，3 d后观察细胞病变，根据Reed等［7］描述的方法计算中和指数。

1.3.6 免疫组化:正常人脑组织石蜡切片脱蜡。3%双氧水室温孵育10 min，以消除内源性过氧化物酶的活性。蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min。用枸橼酸盐缓冲液抗原修复后，用 10%正常山羊血清(PBS稀释)封闭，室温孵育10 min。倾去血清，滴加一抗工作液(将各重组蛋白分别免疫小鼠后得到的抗血清)，4℃过夜。PBS冲洗3次。滴加二抗工作液(辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG)，37℃孵育30 min后，PBS冲洗3次。DAB显色，自来水冲洗，复染，封片，晾干，用光学显微镜观察显色结果［8］。

1.3.7 动物感染:动物感染实验对象为1日龄的ICR幼鼠。攻毒前禁食8 h，每只幼鼠攻毒剂量为:5×107TCID50，病毒悬液体积为 50 μL，感染方式为腹腔注射，分别在攻毒后 1 d，3 d，5 d，7 d解剖幼鼠，收集小肠及骨骼肌样品，用于半定量PCR和病理分析。

1.3.8 半定量PCR:称取30 mg的肌肉组织用于RNA提取。提取使用 Qiagen试剂盒，反转录使用ReverTra-Plus试剂盒进行，cDNA扩增使用随机引物，半定量 PCR使用 EV71特异性引物 HEV71-S:5’-GCAGCCCAAAAGAACTTCAC-3’ 和 HEV71-A 5’-ATTTCAGCAGCTTGGAGTGC-3’，其扩增区域对应于基因组中的碱基位置为:2372–2598［9，10］。使用GAPDH基因做定量内参。

1.3.9 病理观察:免疫及攻毒的小鼠安乐处死后，用10%的福尔马林固定组织样本，修块后石蜡包埋，使用苏木素伊红染色，随后光学显微镜下观察病理变化。

2 结果

2.1 抗原表达与纯化

5种融合亚单位抗原分别包含3个肽段区域，其编码区大小，3个肽段编码区之间分别以蛋白Linker编码序列连接，并与6×His tag融合(图1)。

目的基因在大肠杆菌中表达，蛋白均以不可溶的包涵体形式表达，表达的蛋白经过镍柱亲和层析纯化后，纯化蛋白经 SDS-PAGE检测，其纯度达到95%以上(图2)

图1 融合抗原表达构建示意图Fig.1 Diagram for fusion antigens expression

图2 SDS-PAGE检测纯化的融合抗原Fig.2 SDS-PAGE detect the purified fusion antigens

2.2 抗原与人脑组织的免疫交叉反应

病毒的抗血清与正常人脑组织间存在明显的交叉反应，重组蛋白VacA，VacD和VacE与正常人脑间的交叉反应与全病毒相似，而VacB和VacC与正常人脑间不存在交叉反应，该结果表明，VacB和VacC两种抗原无潜在的引发神经毒性的能力(图3，见彩插 2)。

2.3 病毒中和指数

用5种重组蛋白分别免疫小鼠。初次免疫后，将4周、5周与7周采集血样所得到的抗血清，分别进行病毒中和实验，进而检测其面临病毒攻击时对于RD细胞的保护能力。检测结果用中和指数表示(图4)。经过两次免疫后，灭活病毒免疫的抗血清的中和指数可达29以上，虽然其它重组蛋白的抗血清的中和指数较低，VacB与VacE抗血清的保护能力明显高于其它三种，其中和指数均达到27。表明这两种重组蛋白具有较好的保护效果，并且其抗血清的中和指数在第二次免疫后四周时(幼鼠出生时)仍高于26，推测透过胎盘屏障的母源抗体可以赋予幼鼠良好的抗病毒保护能力。

2.4 动物保护效果

为进一步验证各重组蛋白对于小鼠的保护能力，在雌性小鼠第二次免疫后一周交配;随后对1日龄幼鼠进行攻毒试验，在5 d后解剖幼鼠取材，通过半定量PCR鉴定骨骼肌的病毒拷贝数，观察骨骼肌与小肠的病理表现。综合这两项指标来验证在面临病毒感染时，抗原对于幼鼠的保护效果。

半定量PCR结果见图5，阴性对照组幼鼠(大肠杆菌裂解上清免疫雌鼠)的组织内可以检测到明显的病毒RNA;与阴性对照组相比，各重组蛋白免疫的幼鼠骨骼肌中病毒含量均明显下降，其中VacB与VacE组的病毒RNA检测不到，效果与灭活全病毒免疫效果相同［11］。

图4 各重组蛋白抗血清的中和指数Fig.4 Neutralization titer of the anti-sera of antigens

图5 半定量PCR检测骨骼肌中病毒RNAFig.5 Semi-quantitative detect the viral RNA in skelet al muscle

骨骼肌与小肠的病理观察结果见图6(见彩插3)，与半定量PCR结果一致，阴性对照组的骨骼肌可见明显的肌纤维变性与坏死，小肠绒毛间质水肿及上皮细胞空泡变性。VacA，VacC和VacD免疫组的幼鼠组织病变弱于阴性对照组，但是也可见到明显的病变。而VacB与VacE组的幼鼠与灭活全病毒免疫组相同，组织未见明显的病变。

以上结果表明，VacB与VacE两组重组蛋白的幼鼠保护效果明显，可以起到与灭活病毒相同的抗病毒保护作用。

3 讨论

通过以上实验，表达纯化 EV71多肽链的亚单位肽段融合抗原，得到了五种重组蛋白作为备选疫苗;经过体内外保护性评价试验，得到两种具有较好保护性能的备选疫苗;结合与正常人脑免疫交叉反应的筛选，得到一株既无潜在神经毒性能力，又具有良好保护效果的疫苗:证明VacB可以应用于预防EV71感染的临床研究。

进入上世纪九十年代，亚洲地区爆发的 EV71主要以C亚型为主，而中国大陆地区则以C4为主要流行亚型。CDC的检测报告则表明，中国的EV71流行株保守性很高，未检测到变异，病毒传播过程中的保守性为制备具有长期保护效果的疫苗提供了可能［10，12］。

目前所报道的 EV71疫苗，主要是集中在灭活的全病毒疫苗或者EV71结构蛋白组成的病毒颗粒类似物［13，14］，传统意义上的灭活病毒疫苗，由于包含病毒的全部功能性蛋白与核酸，而被认为存在一定的风险。通过我们的实验证明，集中优势抗原的亚单位疫苗将是取代全病毒疫苗的研制方向。

由于各重组蛋白分别与正常人脑组织细胞中可能存在相同或相似的抗原决定簇，抗体可能会与其结合而对人体产生潜在的神经毒性作用。因此，必须对作为备选疫苗的各重组蛋白进行安全性评价，即进行免疫组织化学试验检测人脑组织样本的未知蛋白靶点，筛查排除可以与其发生交叉反应的重组蛋白。

VP1蛋白被认为集中了优势的抗原决定簇，被用来制备亚单位疫苗。但是我们认为，VP1蛋白的体内保护性能远不及全病毒灭活疫苗［15，16］。为进一步寻找潜在的优势抗原决定簇位点，本实验采用融合数个肽段的策略，表达了五种针对EV71的联合亚单位融合抗原。五种抗原均以不可溶的包涵体形式表达，有利于去除来自于细菌中的内毒素。通过体内外的中和试验，筛选出两种具有良好保护效果的抗原:VacB和VacE。

VacB包含 VP4蛋白，VP3蛋白的 C端和 VP1蛋白的 N端。VacE包含 VP4蛋白，VP3蛋白的 N端和3D蛋白的N端。这就表明，除了VP1蛋白外，VP4蛋白，VP3蛋白与3D蛋白也具有潜在的优势抗原决定簇。结合免疫组化实验，证明VacB既具有良好的体内外保护效果，又无潜在的神经毒性，完全可以应用于临床研究。

［1］Ho M.Enterovirus 71:the virus，its infections and outbreaks［J］.Microbiol Immunol Infect，2000，33(4):205－216.

［2］He YX，Fu D，Cao DZ，et al Critical care and therapy based different illness state of 80 patients with severe hand-foot-andmouth disease seen in Shenzhen［J］.Chin J Pediat，2009，47(5):338－343.

［3］Oberste MS，Penaranda S，Maher K，et al.Complete genome sequences of all members of the species human enterovirus A［J］.J Gen Virol，2004，85(Pt 6):1597－1607.

［4］Chen HF，Chang MH，Chiang BL，et al.Oral immunization of mice using transgenic tomato fruit expressing VP1 protein from enterovirus 71［J］.Vaccine，2006，24(15):2944－2951.

［5］杜月英，丁钢强.中医药治疗手足口病临床研究［J］.浙江中医药大学学报，2008，32(3):343.

［6］He YQ，Yang H，Li LL，et al.Genotype analysis of enterovirus type 71 detected from patients with hand-foot-mouth disease in Shenzhen［J］.Chin J Epidemiol，2008，29(8):790－793.

［7］Bradford MM.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding［J］.Anal Biochem，1976，72:248－254.

［8］Reed LJ，Muench H.A simple method of estimating fifty percent endpoints［J］.Am J Hyg，1938，27:493－497.

［9］Arita M，Ami Y，Wakita T，et al.Cooperative effect of the attenuation determinants derived from poliovirus sabin strain is essential for attenuation of enterovirus 71 in the NOD/SCID mouse infection model［J］.J Virol，2008，82(4):1787－1797.

［10］Yang CF，De L，Yang SJ，et al.Genotype-specific in vitro amplification of sequences of the wild type 3 polioviruses from Mexico and Guatemala［J］.Virus Res，1992，24(3):277－296.

［11］朵建英，王卫，佟巍，等.肠道病毒71型(EV71)对 ICR小鼠的感染［J］.中国比较医学杂志，2009 19(5):41－46.

［12］Li L，He Y，Yang H，et al.Genetic characteristics of human enterovirus 71 and coxsackievirus A16 circulating from 1999 to 2004 in Shenzhen，People’s Republic of China［J］.J Clin Microbiol，2005，43(8):3835－3839.

［13］Li RQ，Chen LJ，Wang YM，et al Genetic characteristics of enterovirus 71 isolated in Beijing，2006－2008［J］.Chin J Epidemiol，2009，30(1):45－49.

［14］Chung YC，Ho MS，Wu JC，et al.Immunization with virus-like particles of enterovirus 71 elicits potent immune responses and protects mice against lethal challenge［J］.Vaccine，2008，26(15):1855－1862.

［15］Ong KC，Devi S，Cardosa MJ，et al.Formaldehyde-inactivated whole virus vaccine protects a murine model of Enterovirus 71 encephalomyelitis against disease［J］.J Virol，2009，84(28):661－665

［16］Wu CN，Lin YC，Fann C，et al，Ho MS.Protection against lethal enterovirus 71 infection in newborn mice by passive immunization with subunit VP1 vaccines and inactivated virus［J］.Vaccine，2001，20(5－6):895－904.

Preparation of Subunit Vaccine for Human Enterovirus 71

HAO Yi，QIN Chuan
(Institute of Laboratory Animal Sciences，Peking Union Medical College and Chinese Academay of Medical Science，Key Laboratory of Human Disease Comparative Medicine，Ministy of Health，Beijing 100021，China)

Objective To prepare the fusion subunit vaccine candidates against human enterovirus 71 by overexpression in prokaryotes，and to evaluate the protection effect of that by mice infection model.Method Fusion subunit peptides of EV71 was over-expressed in Escherichia coli and applied in female mice immunity.The female mice were then sent to mate and the neonatal mice were infected by EV71.The validity of vaccine candidates was evaluated by monitoring the virus copy number and histopathology in mice tissue.Result Five vaccine candidates:VacA，VacB，VacC，VacD and VacE were prepared through peptides fusion expression in E.coli，and most of these candidates showed significant protection effect against EV71 infection in vitro.Meanwhile，VacB and VacC didn’t show any cross reactivity to human brain tissue.However，both VacB and VacE could confer the ability to defense EV71 infection.Conclusion The subunit vaccines for EV71 were evaluated by mice infection model，two candidates:VacB and VacE show perfect protection effect both in vitro and in vivo.Furthermore，VacB doesn’t show any cross reactivity to human brain tissue and can be used as potential no neurological toxicity vaccine for clinical therapy.

Human enterovirus 71;Subunit fusion vaccine;Mice

R373.2

A

1671-7856(2010)06-0007-06

2010-03-08

图3 兔疫组化检测各重组蛋白的抗血清与正常人脑组织的交叉反应
注：A，阴性对照，大肠杆菌裂解上清；B，灭活病毒；C，VacA；D，VacB
Fig.3 Immunohistochemistry observation of the cross reactivity betWeen antigens and human brain tissue
Note:A， negative control， E.coli lysate; B， Inactivated virus; C， VacA; D， VacB

图6 病理观察攻毒后幼鼠的骨骼肌与小肠组织
注：A-D: 骨骼肌，E-H:小肠；A、E: 阴性对照，大肠杆菌裂解上清兔疫组；B、F:灭活病毒兔疫组；C、G: VacA 兔疫组；D、H: VacB 兔疫组；组织样品来源于攻毒5 d后的幼鼠；箭头指示：A、C: 骨骼肌肌纤维变性与坏死;E、F: 小肠绒毛上皮细胞空泡变性。
Fig.6 Histopathology observation of the skelet al muscle and small intestine in EV71 infected mice
Note: A-D， skelet al muscle，E-H:small intestine; A，E: negative control， E.coli lysate; B，F: inactivated virus; C，G: VacA; D，H: VacB; the samples Were isolated from the tissue of neonatal mice in 5 day after EV71 infection. ArroWs：A，C: degeneration and necrosis of skelet al muscle fiber; E，F: degeneration of small intestinal villus epithelial cell.

实验动物技术平台(2009ZX10004-402)。

郝翊(1983－)，女，硕士生，研究方向:病理学与病理生理学。E-mail:peggy83510@sohu.com

秦川，女，教授，博士生导师。