实验动物皮肤病原真菌检测方法的改良

周莎桑，戴方伟，宋晓明，柯贤福，周文伟，萨晓婴

(浙江省医学科学院，浙江省实验动物与安全性研究重点实验室，杭州 310013)

实验动物皮肤病原真菌检测方法的改良

周莎桑，戴方伟，宋晓明，柯贤福，周文伟，萨晓婴

(浙江省医学科学院，浙江省实验动物与安全性研究重点实验室，杭州 310013)

目的 对实验动物皮肤病原真菌2种培养方法进行了比较。方法 将采集到的3只皮肤真菌感染病兔样品经由沙氏平皿法和沙氏试管斜面培养法分别进行培养。结果 在3只真菌感染病兔中应用试管斜面法我们只检测到1例皮肤病原真菌阳性，而采用沙氏平皿法3例阳性全部检出。结论 结合临床检测经验，我们认为本研究的沙氏平皿法优于沙氏试管斜面法，在实验动物皮肤病原真菌常规检测中具有推广应用价值。

实验动物;皮肤病原真菌;检测方法;改良

皮肤病原真菌是小鼠、大鼠、兔等实验动物常见致病菌，在各类实验动物中必须排除。作者在长期实践中发现，真菌的检出率与真菌的培养方法有很大的关系。国家标准GB/T14926.4－2001中实验动物皮肤病原真菌检测要求采用沙氏试管斜面三点培养法［1］，在常规检测中我们发现，由于试管斜面面积小，当多种菌混合生长时，在对斜面培养物进行DTM平皿转接时很难采集到可疑菌，从而造成漏检。因此，我们对此进行了改良，采用沙氏平皿培养法。

1 材料和方法

1.1 实验动物

新西兰兔由某单位兔房提供［SCXK(浙)2009-0039］。选取3只疑似自然感染皮肤病原真菌病兔，临床症状可见耳根部及耳周围有多处白色结痂，大小不等，突出于皮肤表面，与周围界限比较清晰，取样时结痂不易剥落，强行剥离时会有血液渗出。结痂周围皮毛较少，粗糙无光。

1.2 培养基

葡萄糖蛋白胨琼脂(沙氏培养基)、皮肤癣菌鉴别琼脂(DTM)、乳酸酚棉蓝染色液，按中华人民共和国国家标准，微生物学检测方法［1］GB/T14926.43-2001 4.16和4.17方法进行配制。

1.3 病原培养方法

将采集到的3只真菌感染病兔样品分两种培养方法分别进行培养:一种为国标皮肤病原真菌检测方法中所采用的试管斜面培养法;另一种是我们进行改良的沙氏平皿法，即将沙氏培养基倒于平皿，每皿约20mL，待冷却后备用。无菌采集皮肤真菌感染病兔病灶附近结痂块及毛发接种于试管斜面和平皿培养基上，置于28℃培养箱中培养，培养14 d后转入DTM鉴别琼脂培养基，28℃培养7 d。

1.4 结果鉴定

根据沙氏培养基上菌落形态，DTM鉴别琼脂及乳酸酚棉蓝染色结果进行菌株鉴定。

2 结果(图1～3见彩插7)

2.1 沙氏培养基两种培养方法比较

沙氏培养基两种培养方法培养结果见表1。由表1可见，1号兔、2号兔平皿培养法，3号兔试管斜面培养法菌落形态相对较单一，仅随培养时间的增长菌落大小发生改变。2号兔试管斜面菌落形态未见明显变化，第7～14天菌落由白色变为棕黄色(详见表1)。1号兔试管斜面培养菌落生长迅速，第3天已充满斜面并向上生长，形态为白色及灰色绒毛状。第7天试管上端出现黄色颗粒状菌落，培养至14 d黄色颗粒状菌落变为咖啡色(图1A)。3号兔平皿培养第3天菌落形态较小，为白色粉末状及咖啡色颗粒状并有皱折，菌落背面为棕黄色。第7天菌落形态逐渐增大，第14天菌落已基本铺满整皿，咖啡色颗粒状居多(图1B)。

2.2 DTM(鉴别琼脂)培养结果

沙氏培养基培养第14天后，转接DTM培养基继续培养，结果3个样本平皿法培养的菌落均能使DTM由黄变红，菌落形态及色泽与病原真菌沙氏培养判定标准较一致，而试管斜面法培养的菌落仅3号样能使DTM由黄变红，其余均未变色(图2)。

2.3 真菌菌株鉴定

结果显示沙氏平皿法在3个样本中均培养出皮肤病原真菌，经鉴定为石膏样毛癣菌，试管斜面法仅3号兔检出皮肤病原真菌，鉴定结果为石膏样毛癣菌，乳酸酚棉蓝染色镜检见许多小分生孢子圆形，单个或成丛，有螺旋菌丝(图3A)，大量棒状大分生孢子2～6个隔(图3B)。

3 讨论

石膏样毛癣菌是实验动物主要致病性真菌之一，主要引起人兽共患的皮肤病［2］。真菌多以孢子的形式传播和存在，一般情况下难以清除干净［3］。病兔是其主要传染源，且可在兔－人之间传播［4］，尤其是饲养员，浙江省某兔房就发生过一例饲养人员被感染的病例［3］。因此为了保障科学实验的准确性和避免人员受染，应定期对实验动物进行监测并做好环境消毒等工作。

本研究比较了沙氏试管斜面法和沙氏平皿法后发现，平皿法较试管斜面法操作方便，且较易分离可疑菌。1号样在试管斜面培养3 d后菌落已布满斜面并沿管壁向上生长，且菌落不单一，灰色及白色绒毛状夹杂生长，而临床需要分离的仅为白色绒毛状可疑菌。由于不同菌落混杂，灰色杂菌呈优势生长，加之试管斜面面积较小，不易挑取单一菌落，故转种DTM后目标菌因被杂菌掩盖而未能与沙氏培养结果保持一致(图2)。我们在临床检测中也常遇到同样的难题，因多种菌落混合生长导致转种DTM时极易夹杂其他霉菌。一旦杂菌在DTM呈优势生长，往往无法检出病原真菌。3号样在沙氏平皿法中菌落并不单一(图1)，随着培养时间的延长，其他霉菌类也在平皿上形成了优势生长，但平皿培养表面较大可使标本散布，便于观察菌落形态及较方便地采集可疑菌［5］。经转接DTM平皿后，平皿法所培养的3个样品菌落形态及色泽与沙氏培养结果完全吻合，未发生变异。在本研究的试管斜面培养法中，仅3号样品的沙氏培养为单一菌落，故转种后菌落形态及色泽与沙氏培养结果一致，未发生变异。综上所述，我们认为，平皿法可弥补因试管法斜面面积过小、空间过窄而影响病原真菌分离鉴定中敏感性不足的缺陷。另外，由于试管斜面面积小，培养基厚薄不均，导致真菌较易发生变异，可能出现形态结构、菌落性状、色素以及各种生理性状(包括毒力)的改变，影响病原真菌分离与鉴定的准确性，因此在实验动物皮肤病原真菌接种分离培养时，我们建议沙氏平皿法代替试管斜面法。

表1 沙氏试管斜面法与沙氏平皿法对家兔皮肤病原真菌检测的比较Tab.1 Diagnostic comparison of pathogenic dermatophytes by Sabouraud's platiculture and slant cultivation

参考文献:

［1］中华人民共和国国家标准［S］.GB/T14926.4-2001实验动物微生物学检测方法(2).

［2］Kunstyr I， Jelmek F， Bitzenhofer U， et al.Fungus paccilomyces:a new agent in laboratory animals［J］.Lab Anim Sci，1997，31(1):45－51.

［3］韦强，佟承刚.家兔石膏样毛癣菌病的诊治［J］.中国养兔杂志，1993，4:6－7.

［4］李金永，刘振华，孙华，等.家兔体表真菌病的防治［J］.兽药市场指南，2005，6:40－40.

［5］倪语星，尚红.临床微生物学与检验(第4版)［M］.北京:人民卫生出版社，2008.

Modification of the Detection Method for Pathogenic Dermatophytes in Laboratory Animals

ZHOU Sha-sang，DAI Fang-wei，SONG Xiao-ming，KE Xian-fu，ZHOU Wen-wei，SA Xiao-ying
(Zhejiang Academy of Medical Sciences，Zhejiang Provincial Laboratory of Experimental Animal and Safety Evaluation Research，Hangzhou 310013，China)

Objective To compare the modified method with one conventional method for diagnosis of pathogenic dermatophytes in laboratory animals.Methods Three samples were obtained from rabbits with pathogenic dermatophytes and inoculated on Sabouraud's platiculture and slant cultivation.After incubation for at least 14 days，pathogenic dermatophytes were detected according to the national standards.Results By Sabouraud's platiculture we confirmed three pathogenic dermatophytes whereas only one out of three were detected by Sabouraud's slant cultivation.Conclusion It can be concluded that the modified method(Sabouraud's platiculture)is more suitable than the slant cultivation for diagnosis of pathogenic dermatophytes in laboratory animals and therefore might be recommended for future use in clinical diagnosis.

Laboratory animals;Pathogenic dermatophytes;Detection methods;Modification

R-333

B

1671-7856(2010)06-0058-03

2010-03-03

图1 两种沙氏培养方法的比较
Fig.1 Comparison of Sabouraud's platiculture and slant cultivation for detection of pathogenic dermatophytes

注：A为沙氏试管斜面培养14 d，B为沙氏平皿培养14 d。
Note: Samples Were cultured for 14 days on Sabouraud's slant culture (A)and Sabouraud's plate (B)

图2 DTM培养结果
Fig.2 Detection of pathogenic dermatophytes by DTM agar

注：各图中，左侧皿均为沙氏试管斜面转DTM平皿，右侧皿为沙氏平皿转DTM平皿。
Note: In No. 1， 2 and 3， samples previously cultured by Sabouraud's slant cultivation Were inoculated on the left DTM plate;those previously incubated on Sabouraud's plate Were inoculated on the right.

图3 石膏样毛癣菌镜检结果（乳酸棉酚蓝染色，400×）
Fig.3 Diagnosis of gypsum-like Trichophyton rubrum by optical microscopy (Lactophenol cotton blue stain， 400×)

注：A: 螺旋菌丝B: 棒状大抱子
Note：A: Spiral hyphae; B: Stick-shaped megaspore

周莎桑(1983－)，女，助理实验师，主要从事实验动物质量控制与疾病实验动物模型研究。E-mail:zhoushasang@163.com

周文伟。