异种动物血清对体外培养人肿瘤细胞生长的影响

赵秀梅，冯文茹，胡人杰

(天津市医药科学研究所，天津 300020)

异种动物血清对体外培养人肿瘤细胞生长的影响

赵秀梅，冯文茹，胡人杰

(天津市医药科学研究所，天津 300020)

目的 观察不同种属来源和浓度的动物血清对体外培养的肿瘤细胞(A549、MCF－7、BGC－823)生长的影响。探讨血清药理实验中血清供体动物的选择及血清添加量的问题。方法 设置5种血清(牛、人、兔、大鼠、小鼠)及血清量(10%、20%、40%、60%、80%)的培养体系，用MTT法检测细胞增殖情况。结果 不同种属来源的动物血清对肿瘤细胞生长的影响作用各不相同。从总的趋势来看，牛血清更适宜人肿瘤细胞生长，小鼠血清适应性最差。且随着加入量的增加，大多数血清会对肿瘤细胞的生长产生负效应。结论 在肿瘤血清药理学试验中，为排除血清本身带给试验的干扰，应测定正常动物血清对肿瘤细胞增殖的影响，且血清添加量以小于20%为宜。

血清;细胞;MTT

血清是细胞培养中最常用的添加成分，它是一种复杂的混合物，其中含有很多细胞生长所必需的营养成分和细胞因子。它不仅可以影响细胞的分化，而且对细胞的增殖也具有重要的意义。近年来随着血清药理学工作的广泛开展，除牛血清之外其他种属动物来源的血清也开始出现在细胞培养体系中。这就提出了一个问题，不同种属的动物血清对于细胞的生长是否有不同的影响。有研究发现，Beagle犬血清与胎牛血清对体外培养人肺癌细胞QG－56的生长无显著性差异［1］。也有研究表明，在细胞培养体系中，不同种属动物血清对细胞生长的影响似与其种属亲缘有关，亲缘越接近的血清越适于该细胞生长［2］。我们结合当前开展的肿瘤血清药理学试验工作，观察了不同种属来源的动物血清对体外培养的人肿瘤细胞生长的影响，以期为今后的研究工作提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 动物及血清:SPF级SD大鼠，SPF级ICR小鼠，均由北京大学医学部实验动物科学部提供［SCXK(京)2006－2008］;新西兰兔，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供［SCXK(京)2005－0002］。健康人血清，天津市第三中心医院生化室惠赠。

1.1.2 细胞株:A549人肺癌细胞株，MCF－7人乳腺癌细胞株，BGC－823胃癌细胞株，由本单位瘤源室提供。

1.1.3 试剂:RPMI－1640培养基、胰蛋白酶均购自GIBCO公司;小牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司;MTT、二甲基亚砜(DMSO)均购自北京欣经科生物技术有限公司。

1.1.4 仪器:Wellscan MK 3酶联检测仪，Labsystems Dragon芬兰产;CO2孵箱，Heraeus美国产;96孔板，Greiner德国产;离心机:北京医用离心机厂。

1.2 方法

1.2.1 血清的制备及灭活:动物予正常饮食，预适应1周后，无菌条件下，大鼠自腹主动脉，小鼠自眼球后静脉丛，兔从心脏取血，将采集到的血液样本室温静置 1 h后，3000 r/min，离心20 min，分离血清，同种血清等量混合，56℃ 水浴灭活 30 min，0.22 μm 微孔滤膜过滤除菌，置－20℃冰箱保存，2周内使用。

1.2.2 MTT法检测异种动物血清对细胞增殖的影响:取对数生长期细胞(A549、MCF－7、BGC－823)DHank’s液洗涤2次，0.25%胰蛋白酶消化，离心，弃上清液，用 RPMI－1640培养液配成1×105个/mL单细胞悬液。于96孔板中，每孔加入100 μL细胞悬液，于37℃，5%CO2孵箱中培养24 h，待细胞贴壁后，弃去上清。每孔分别加入20、40、80、120和160 μL血清样本(牛、人、兔、大鼠、小鼠)，每个浓度设5个复孔，余下用不含牛血清 RPMI－1640培养液补齐，使反应总体积为 200 μL(血清浓度为 10%、20% 、40% 、60% 、80%)。37℃，5%CO2孵箱中继续培养 48 h。细胞培养完毕，弃上清，每孔加入MTT 溶液(0.25 mg/mL)200 μL，37℃ 继续孵育 4 h，弃上清，每孔再加入150 μL二甲基亚砜，振荡 10 min，酶标仪570 nm波长处测光密度(A)值。

1.3 统计学处理

采用SAS9.0统计软件进行单因素方差分析及显著性检验，所有实验数据均以±s表示。

2 结果

2.1 血清来源的种属差异对肿瘤细胞生长的影响

从表1～3中可以看出，以牛血清对3种细胞生长影响较小。如在不同浓度，对于 A549和 BGC－823，牛血清组的A值与其他同浓度的血清组相比基本上是最高的。而对于MCF－7细胞，虽然牛血清组的细胞增殖能力不是最好的，但通过统计，从总的趋势来看与同浓度A值最高的血清组相比较，并没有显著差异(P＞0.05)。相比而言，小鼠血清的影响就较大。如除了10%血清对 MCF－7细胞表现促进增殖的作用外，小鼠血清各浓度组对3种细胞生长基本上都是抑制作用。人、兔、大鼠的血清则对3种细胞生长影响作用居中。

表1 异种血清对A549细胞生长的影响(A值，n=5)Tab.1 The influence of different kinds of animal serum on A 549 cell line(A value，n=5)

表2 异种血清对MCF－7细胞生长的影响(A值，n=5)Tab.2 The influence of different kinds of animal serum on MCF－7 cell line(A value，n=5)

表3 异种血清对BGC－823细胞生长的影响(A值，n=5)Tab.3 The influence of different kinds of animal serum on BGC－823 cell line(A value，n=5)

2.2 血清添加量对肿瘤细胞生长的影响

总体而言，随着加入量的增加，会对肿瘤细胞的生长产生负效应。如小鼠血清对A549和MCF－7细胞，兔血清对MCF－7和BGC－823细胞以及大鼠血清对A549细胞，均随浓度的增加，对细胞生长的抑制作用逐渐增强，呈现出一定的剂量依赖性。血清浓度为10%时，相对小牛血清而言，出现“抑制”细胞生长的只有小鼠血清对 BGC－823细胞和大鼠血清对MCF－7细胞(P＜0.05)，当血清提高到20%，这种“抑制性”影响的机会增加到6次之多，血清量再增加，这种“机会”均在7次以上。这从另一侧面验证了常规肿瘤细胞培养血清含量选择10%是有道理的。

3 讨论

随着血清药理学的运用，通过含药血清进行体外研究比药物直接接触培养体系更具有体内药物作用的可拟性。因此，通过给培养体系加用含药的血清进行研究日益受到重视。但常规制备的正常血清本身也会对培养体系具有作用，而且培养体系中的血清量越大，这种背景作用也越明显，甚至当血清浓度超过一定限度时会产生对培养体系的毒损作用［3］。而从本实验结果来看，不同种属的动物血清对人肿瘤细胞的作用浓度是有一定限制的，当达到20%或更高时大多数表现出较为明显的损伤特征。

另外，以往的相关研究中，杨树青等［4］曾经用不同种属来源的血清(兔、大鼠、小鼠、豚鼠)来培养小鼠的肝细胞和HAC(小鼠腹水型肝癌)细胞，其结果发现不同的血清对细胞的损伤效应与血清供体和靶细胞的亲缘关系有关，它们之间的亲缘关系越远，损伤效应的活性越高，同种血清则没有明显的作用。也有研究表明，血清对种属来源相同或相近的细胞都表现出更好的增殖能力［2，5］。因此，在血清药理学研究中，是否血清的供体与细胞的亲缘关系越近，对实验的整体影响就应该越小，且其含药血清的作用就更能明确的反映药物作用，与体内实验也能表现出一定的相关性。但本次实验的结果不同于前人的研究，并非种属亲缘关系越近越利于细胞生长，相比较而言以牛血清对细胞生长的影响较小，小鼠血清影响较大，人、兔、大鼠影响作用居中。我们考虑牛血清组细胞生长最佳的原因可能有二方面:一是长期培养的适应;二是小牛(胎牛)血清未接受免疫刺激，血清成分较为“单纯”，而人血清的表现则可能是由于个体差异所致。

总之，从实验结果来看，在血清药理学研究中，应特别注意对照组的设置，尤其是在选择一些种属动物进行实验时更应该引起重视。同时还必须进行正常血清及含药血清的细胞毒实验，以确定最大的给药血清浓度，尽量减少血清本身带给实验的影响。

参考文献:

［1］余宗阳，欧阳学农，杜建，等.Beagle犬血清与胎牛血清生化特性及其对体外培养的人肺癌细胞生长的影响［J］.中国比较医学杂志，2009，19(5):26－30.

［2］吴健宇，穆静，李仪奎.血清药理实验中异种动物血清对细胞的毒性作用和灭活后的减毒作用［J］.中国药理学通报，2000，16(1):118－119.

［3］秦英，杨君，姜良铎，等.常规制备家兔血清对人脐静脉内皮细胞－304的影响［J］.中国中西医结合杂志，2001，21(11):845－848.

［4］杨树青，王宝平，倪火洲.血清对异种细胞的损伤效应［J］.上海免疫学杂志，1981，1(6):16－19.

［5］郭雄明，薛霞，谢中忱.兔血清制备及兔来源细胞培养实验［J］.实验动物科学与管理，2005，22(4):10－12.

The Influence of Different Kinds of Animal Serum on the Growth of Human Tumor Cells Cultured in Vitro

ZHAO Xiu－mei，FENG Wen－ru，HU Ren－jie
(Tianjin Institute of Medical and Pharmaceutical Science，Tianjin 300020，China)

Objective To observe the influence of serum in various species and concentrations on the growth of tumor cells(A549，MCF－7，BGC－823)for investigating the serum donators and added quantity in serum pharmacological experiment.Methods Five kinds(bovine，human，rabbit，rat，mouse)and concentrations(10% ，20% ，40% ，60% ，80%)of serum were set and MTT assay was applied to detect the growth of human tumor cells.Results The different species of serum on the growth of tumor cells was dissimilar.As a whole，the bovine serum was more suitable for human tumor cell growth and the worst the mouse serum.With the concentration of added serum increased，the majority of serum had a negative effect on the growth of tumor cells.Conclusions In order to avoid the interference by serum itself，the control animal serum on the effect of tumor cells should be measured when using serum pharmacological test method，and the added serum quantity is optimal for less 20%.

Serum;Cell;MTT

R965

A

1671－7856(2010)06－0035－04

2010－01－11

天津市卫生局中医、中西医结合科研课题(07038)。

赵秀梅(1975－)，女，助理研究员，硕士，从事中药药理和肿瘤药理研究。E－mail:zxmmlg@eyou.com

胡人杰(1955－)，男，研究员，硕士生导师。E－mail:renjiehu@163.com