肥胖儿童少年内脂素RS4730153位点基因多态性与运动干预前、后糖代谢和脂代谢变化

赖爱萍,陈文鹤

肥胖儿童少年内脂素RS4730153位点基因多态性与运动干预前、后糖代谢和脂代谢变化

赖爱萍1,2,陈文鹤1

目的:探讨肥胖儿童少年内脂素RS4730153位点基因多态性及其与运动干预引起糖代谢和脂代谢变化的关系。方法:对88名年龄为144.11±3.63岁,BM I为29.26±4.44的汉族肥胖儿童少年(男40名,女48名)进行封闭式的4周中等强度有氧运动减肥,LDRPCR测序分型技术确定受试者内脂素RS4730153位点基因型,并在运动干预前后进行糖代谢和脂代谢指标的测定。结果:受试者A/G基因型出现频率为15.9%,有氧运动前后各指标呈显著性变化,不同基因型受试者运动前TG水平呈显著性差异(分别为GG:1.40±0.74 mmol/L;AG:1.86±1.11mmol/L;P=0.050),运动引起的不同基因型受试者HOMA-β变化差异显著(P=0.050)。结论:所测中国汉族肥胖儿童少年中存在内脂素单核苷酸多态性位点RS4730153变异,RS4730153纯合子GG型可能可以通过降低TG水平、提高胰岛素对运动干预的敏感性等方面参与肥胖儿童少年的糖代谢和脂代谢调节。

内脂素;基因多态;肥胖儿童少年;糖代谢;脂代谢

1 前言

增加运动与活动,改善机体的适应能力是治疗肥胖及其继发病的一条安全有效的措施[3]。在运动干预肥胖人群的研究中,发现,同样的运动干预对于不同肥胖人群的减肥效果却不尽相同,其原因可能是由于人体在肥胖相关因子的基因水平上存在着差异所致[4]。Johansson L M等[13]、Böttcher Y等[6]、Blakemore A I等[5]均发现内脂素基因多态性可能可以作为肥胖的内在易感因素,说明内脂素的基因多态性在一定程度上可能影响体内糖代谢、脂代谢和肥胖,决定了肥胖与糖代谢及脂代谢能否改变的先天易感性,但这一易感性是否可以像Plin基因等[1]一样能通过运动加强或阻止,能否最终调节有氧运动对肥胖儿童少年减肥效应和程度,迄今为止未见报道。

目前,有关内脂素基因多态性与糖代谢和脂代谢关联的研究主要集中于以下三个位点:启动子-1001 T>G (RS9770242)、启动子-948 G>T(RS59744560)及第6内含子RS4730153。其中对RS4730153位点与糖脂代谢关联的报道不一。有研究[13]发现肥胖人群和健康对照人群之间该位点基因频率或基因型频率均无显著性差异,且无论是哪组人群均未发现该位点与脂代谢指标有关联。但另有报道[6]发现德国Ⅱ型糖尿病患者中该位点A/A基因型者内脏脂肪/皮下脂肪内脂素mRNA表达比例明显低于其他基因型(P<0.05),提示该位点的基因多态与糖代谢、脂代谢似乎有某种关联。相异结果的出现可能与种族、年龄、实验条件等有关,在这些研究中均未对实验条件、实验对象状况等缺乏严格控制和说明,而这些因素均有可能会影响研究结果的客观性和可靠性。加上研究对象大多是成年人,而环境因素对既定的遗传易感性的基因表型会有较大的影响,甚至可能会掩盖复杂基因表型的影响。基于此,对儿童少年进行基因多态性的研究应是更有意义的,因为相对于成年人而言,儿童少年的基因表型很少受并发症、治疗等其他混杂因素的影响。

因此,本研究将以中国汉族肥胖儿童少年为对象,通过连接酶检测-聚合酶链式反应(LDR-PCR)测序分型技术研究内脂素RS4730153位点基因多态性与糖代谢、脂代谢水平的关联以及对运动减肥干预效果的影响。

2 研究对象与方法

2.1 研究对象

参加2008年上海暑期封闭运动减肥夏令营的肥胖儿童少年88名,入营前除了参加各自校内规定的体育课以外均无额外的体育锻炼,年龄14.11±3.63岁,BM I 29.26 ±4.44,均为华东地区汉族人,其中男性40名,年龄13.21 ±3.01岁,女性48名,年龄14.88±3.96岁。入营前均接受专业医生体格检查和病史问询,确定无遗传病史,无吸烟史,无心血管、肝脏、肾脏、肺等疾病史,未曾使用减肥药物。运动减肥过程中除了一例(女性)中途退营以外,其他营员均坚持到4周运动减肥结束。本研究过程经上海体育学院伦理委员会批准,获受试者本人及家长同意并签署书面同意书。

2.2 研究方法

为保证受试者的正常生长发育,入营后每位营员的饮食均由专业营养人士根据各自实际情况和儿童少年发育特点进行配餐和分餐,热能供给比例约为糖∶脂肪∶蛋白质=60%～70%∶10%～15%∶20%～25%,每天用盐< 6 g,保证营养素供能的均衡合理,热能的充足摄入以及食物来源的多样化并进行每周定期的健康教育。营员进行两天饮食适应期后作基因多态性测定,同时作有氧运动前空腹血检,并于4周有氧运动结束后再次进行空腹血检,第二次的测试安排在有氧运动结束后的第二天清晨(约距前一天运动结束18～20 h),以此避免急性运动的影响。

2.2.1 运动处方

为制定合理的运动处方,每位受试者均先进行递增运动负荷试验:安静心电图描记后受试者在平板跑台进行4 km/h,6 km/h和8 km/h 3个递增定量负荷的运动试验,每级负荷持续2 min后,描记负荷后即刻心电图。若心电图出现明显异常、或心率超过最大心率的80%、或受试者主观无法继续坚持试验时终止试验。运动负荷试验结束后描记运动后1 min的恢复心电图,在此基础上由运动专家开设个人运动处方。入营后按此运动处方进行为期4周的有氧运动,运动强度确定为中等强度有氧运动,因为中等强度有氧运动比高强度更有效的减肥[16]。运动频率为每周六天,包括晨练,每天2次,运动时间持续为4周。每次运动时间为120 min(上午:10:00—12:00;下午:15: 00—17:00),包括准备活动、正式运动、整理活动。运动形式选择强度易控制且简单易学的方式如球类、游泳、健身操等。POLAR表用于监测运动中心率并由运动人体科学本科以上学历者进行全程运动强度跟踪监控,专业医务人员作运动医务监督。

2.2.2 血液指标检测

4周有氧运动前后营员分别进行两次静脉取血,均为清晨空腹状态。取血后分别测血脂六项、糖化血红蛋白、胰岛素及血糖,余0.2 ml抗凝血用于内脂素基因多态性测定。空腹血糖(FPG)用葡萄糖氧化酶法、总胆固醇(TC)用酶反应法、甘油三酯(TG)用乙酰丙酮微量测定法、低密度脂蛋白(LDL-C)用聚乙烯硫酸沉淀法、高密度脂蛋白(HDL-C)用磷钨酸镁测定法。空腹胰岛素(FINS)用放射免疫分析法,采用胰岛素敏感性指数[2]ISI=1/FPG×Fins和稳态模型评估法胰岛素抵抗指数HOMA-IR=FPG× FINS/22.5[10]评价胰岛素敏感性,采用稳态模型评估法胰岛β细胞功能指数HOMA-β=20×FINS/(FPG-3.5)[10]作为基础状态下的胰岛素分泌指标。

2.2.3 内脂素基因多态性检测

采用连接酶检测-聚合酶链式反应(LDR-PCR)测序分型技术,样本处理后采用AXYGEN公司的AxyPrep-96全血基因组DNA试剂盒进行总DNA抽提。引物如下:Forward 5’TCCCCCAAGCTGTTATGGTA 3’;

Reverse 5’AAGGTATGGTTGACCCAGCTA 3’,长度200 bp。根据引物和探针的分子量加TE稀释至50 pmol/ μl做为母液,PCR反应体系20μL,3%的琼脂糖凝胶电泳检测,观察PCR产物的效果,确定其作为模板在LDR反应中加入的量。LDR10μl,参数为95℃2 min→94℃30s→50℃2 min。ABI PRISM 377 DNA Sequencer上做测序电泳,应用Genemapper软件进行数据分析和基因分型。

2.3 统计学分析

所有数据均在SPSS 16.0统计软件包里完成,所测数据用均数±标准差±S)表示。运用χ2检验计算受试人群的基因型频率是否符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律,显著性水平为P<0.05。运动干预前后比较采用配对t检验,不同基因型人群之间运动前后糖代谢和脂代谢比较用独立样本t检验,进一步分析用协方差分析(ANCOVA),不同性别不同基因型分组后各指标比较用方差分析(ANOVA)。所有的统计检验均采用双侧检验,显著性水平为P≤0.05,非常显著性水平为P≤0.01。

3 结果

3.1 RS4730153位点基因分型

图1 内脂素RS4730153位点分型截图Figure 1 Screenshots of Visfatin RS4730153 genotypes

聚丙烯酰胺凝胶测序电泳结果显示,88位受试者出现14例A/G基因分型(其中男性8名,女性6名),频率为15.9%,其余受试者均为G/G基因分型,频率为84.1%。等位基因A,G频率为8%,92%。经χ2检验可知,所测的88名汉族肥胖儿童少年内脂素RS4730153多态位点的基因型分布符合H-W平衡(χ2=1.037,df=2,P=0.595)。

3.2 运动干预前后受试者检测指标变化

表1 受试者运动干预前后各指标变化一览表Table 1 Changes in Indexes before and after the Exercise Intervention

可见,各指标均在运动干预前后呈非常显著性变化(P<0.01)。

3.3 RS4730153不同基因型受试者各指标运动前后比较

可知,不同基因型受试者运动前TG水平呈显著性差异(P=0.05),以运动前BM I作协方差进行协方差分析,发现差异仍存在(P=0.043,未在表中显示)。受试者运动后不同基因型间FINS和HOMA-β存在显著性差异,分别以运动前FINS和HOMA-β作协方差进行协方差分析,发现运动后不同基因型间FINS的差异性消失(P=0.064,未在表中显示),而运动后不同基因型间HOMA-β仍存在显著性差异(P=0.050,未在表中显示)。

表2 运动干预前后RS4730153不同基因型受试者之间各指标比较一览表Table 2 Comparing in Indexes before and after the Exercise Intervention with Different RS4730153 Genotypes

3.4 运动前后不同基因型受试者间各指标的性别差异

将人群可分为四组:男性GG组(1)32人、男性AG组 (2)8人、女性GG组(3)42人、女性AG组(4)6人。用ANOVA比较四组运动前后各项指标的差异(表3)。

表3 运动前后各组间有差异的指标列一览表Table 3 List of the Indexes Changing Significently before and after the Exercise Intervention

以运动前HDL/LDL进行协方差分析,发现运动后HDL/LDL的组间差异仍存在。但以运动前FINS对运动后FINS作协方差分析,发现组间差异消失(未在表中显示)。

4 讨论

自2005年Fukuhara等[9]分离出内脂素后,对肥胖及与之相关的胰岛素抵抗人群的内脂素水平及基因表达时有报道,提示内脂素基因变异可能也与肥胖的发展有关。人类该基因位于染色体7q22.1和7q31.33之间,分子量为52kDa,编码491个氨基酸[12](National Center for Biotechnology Info rmation accession number AAA 17884)。包含11个外显子与10个内含子,所有的外显子/内含子剪接点均符合AG/GT规律。

肥胖者血清内脂素浓度与HDL-C负相关,与血清TG正相关[11]。这可能反映了胰岛素抵抗和代谢综合症患者胰岛素敏感性的不同所导致的脂代谢紊乱,即:TG升高而HDL降低。本研究发现在中国汉族肥胖儿童少年人群中,内脂素RS4730153位点不同基因分型组间TG水平有明显差异(GG:1.40±0.74 mmol/L;AG:1.86±1.11 mmol/L;P=0.050),提示RS4730153AA型可能与降低脂代谢紊乱的风险有关。虽然GG型HDL有上升的趋势,但差异不呈显著性(P=0.245),这与国外有关RS4730153位点基因多态性的两篇研究不同[13,15],在Johansson[13]关于瑞典肥胖成人和Korner等[15]关于德国肥胖儿童所作的研究中均未发现RS4730153位点与脂代谢指标有任何关联,出现不同的结果可能是种族差异所致。此外,基因检测方法的不同也可能是造成差异的原因之一。本研究首次发现RS4730153基因多态性与TG水平相关,证实了该位点基因多态性参与了脂代谢的调节。此外,本研究中RS4730153位点的不同基因组间基础胰岛素水平、血糖水平及形态指标均无显著性差异,这与以往研究相似。

运动能影响内脂素水平,这点在人体实验[7,8]和动物实验[14]中均得到验证,但人体研究中基本没有控制饮食的影响,也没有提供让人信服的证据来证明内脂素的变化到底是因为由运动引起还是由体重降低引起的。本研究在保证合理的饮食供给并给予两天的饮食适应期后,发现4周的有氧运动干预能有效地降低了TG、TC及LDL水平,出现了良好的效应。实验中HDL水平在运动后也显著下降,这可能是与本实验的被试入营前均为静态生活人群有关,但是HDL/LDL比例在运动后显著上升,表明有氧运动干预对受试者脂代谢有良好影响。此外,糖代谢指标FPG、FINS等在运动后均显著性下降(P<0.01),说明本次干预是非常有效的。

本研究结果显示,运动后不同基因型人群间Insulin和HOMA-β均存在组间差异,为排除运动前该二项指标的影响,分别以运动前Insulin和HOMA-β作协方差分析受试者运动后不同基因型间Insulin和HOMA-β的差异性,发现Insulin组间差异消失,说明运动后不同基因型间Insulin的差异性是由运动前Insulin水平不同引起。而HOMA-β仍存在组间差异性,说明不同基因型受试者HOMA-β对运动的敏感性不同,RS4730153GG型可能是运动敏感基因型。

值得注意的是,本研究中HOMA-β在运动后显著下降,这似乎与以往研究得出的运动能提高胰岛素β细胞功能的论点相左。然而,受试者糖代谢水平的变化并不能将该指标独立出来讨论,HOMA-β=20×FINS/(FPG-3.5),结合本研究中FINS和FPG两种指标的变化可看出,受试者运动后血糖的降低远低于胰岛素值的降低,这必然会造成由此公式计算出的HOMA-β的变化运动前后的差异性。胰岛素分泌水平受胰岛素抵抗和β细胞功能的双重影响,轻度胰岛素抵抗即可引起较大幅度胰岛素分泌以维持血糖不升高或仅轻度升高。如糖耐量受损者常有胰岛素抵抗,胰岛素水平高于正常糖耐量者较多,血糖仅轻度升高,其20×FINS/(FPG-3.5)值高于后者是预料之中的,但这种影响却掩盖了该人群以这些比值评估的β细胞功能受损程度,因此会出现“糖耐量受损者β细胞功能好于正常糖耐量者”的怪现象。本研究中出现的运动后HOMA-β值的显著性降低,反而印证了运动对受试者胰岛素值的降低,说明运动对胰岛素敏感性的有效改善。而运动后HOMA-β值在不同基因型之间的差异,与上文提到的不同基因型之间胰岛素水平变化的差异相结合,提示了GG型可能是糖代谢的运动敏感性基因。同时提示今后在应用这一公式评估β细胞功能时必须调整胰岛素抵抗的影响,不如此会得出错误结果。

此外,本研究中发现,性别因素对不同基因型人群运动前后糖代谢和脂代谢指标有影响。但由于样本量的限制,本研究中男性女性AG人数仅分别出现8例和6例,今后的研究还需收集更多样本,以对该位点基因多态性与运动干预效果及性别差异的关系作出更明确更深入的研究。

5 结论

所测中国汉族肥胖儿童少年中存在内脂素单核苷酸多态性位点RS4730153变异,RS4730153基因多态性与肥胖人群糖代谢和脂代谢紊乱及运动减肥干预效果有关。纯合子GG型可能可以通过降低TG水平、提高胰岛素对运动干预的敏感性等方面参与肥胖儿童少年的糖代谢和脂代谢调节。

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Single Nucleotide Polymorphisms of RS4730153 in Visfatin Gene and Its Relation to the Exercise-induced Glucose and L ipid Metabolism Changes in Obese Children and Adolescents

LA IA i-ping1,2,CHEN Wen-he1

Objective:To investigate the single nucleotide polymorphisms(SNPs)of RS4730153 in visfatin gene in obese children and adolescents of Han nationality,and analyze its relation to the exercise-induced glucose and lipid metabolism changes.Methods:88 obese children and adolescents(male=40,female=48;age=14.11±3.63;BM I=29.26±4.44)of Han nationality comp leted a 4-week aerobic exercise p rogram to lose weight,and their distribution of genotype was got by using ligase detection-polymerase chain reaction(LDR-PCR).Meanw hile, the indexes of glucose and lipid metabolism befo re and after exercise intervention were determined.Results:The frequency of the visfatin A/G genotype was 15.9%.The indexes of glucose and lipid metabolism befo re and after aerobic exercise showed significant changes.TG levels befo re exercise was significantly different between the different genotypes subjects(GG: 1.40±0.74mmol/L,AG:1.86±1.11mmol/L,respectively,P=0.050).HOMA-βafter exercise was significantly different between the different genotypes subjects(GG:220.50± 178.81,AG:332.23±207.90,respectively,P=0.050).Conclusion:The SNPs of visfatin RS4730153 variation was found in obesity children and adolescents from Chinese Han nationality.Homozygous GG was possibly involved in glucose and lipid metabolism by reducing TG levels and imp roving exercise-induced insulin sensitivity.

visfatin;sing le nucleotide polymorphisms(SN Ps);obese children and adolescents;g lucose and lipid metabolism

G804.7

A

1000-677X(2010)08-0057-05

2010-06-21;

2010-07-28

国家科技支撑计划项目(2006BAK33B04-2);上海市第三期运动人体科学重点学科开放基金课题(S30902)。

赖爱萍(1974-),女,浙江建德人,副教授,在读博士研究生,研究方向为运动生理学,Tel:(0571)89932521,E-mail: lap810@163.com;陈文鹤(1947-),男,上海人,教授,博士研究生导师,研究方向为运动生理学,Tel:(021) 51253250,E-mail:wenhechen@126.com。

1.上海体育学院运动科学学院,上海200438;2.浙江体育职业技术学院体育系,浙江杭州310012 1.Shanghai University of Sport,Shanghai 200438,China; 2.Physical Education Department of Zhejiang College of Sports,Hangzhou 310012,China.