虫草素的微波-超声波协同提取

王 陶，李 文，陈宏伟，陈小龙，刁进进

(徐州工程学院食品(生物)工程学院，江苏 徐州 221008)

虫草素的微波-超声波协同提取

王 陶，李 文，陈宏伟，陈小龙，刁进进

(徐州工程学院食品(生物)工程学院，江苏 徐州 221008)

研究蛹虫草菌丝体中虫草素的提取工艺及检测方法。确定微波-超声波协同提取法为虫草素提取的最佳方法，依据单因素和正交试验获得最佳的提取工艺：乙醇体积分数70%、提取功率200W、提取时间110s、料液比1:240(g/mL)。此时虫草素含量达9.228mg/g。采用紫外分光光度法测定样品中虫草素含量，回收率为97.41%～99.60%，RSD为1.469%，准确度和精密度都较高，是一种方便、成本较低的检测方法。

蛹虫草；虫草素；微波-超声波协同提取；紫外分光光度法

Abstract：Single factor and orthogonal array design methods were used to investigate an optimal procedure for the extraction of cordycepin from cultured mycelia of Cordyceps militaris with the assistance of microwave combined with ultrasonic. Besides,a UV spectroscopic method was developed for the assay of cordycepin and its figures of merit were evaluated. Results showed that the optimal values of crucial technological parameters affecting cordycepin yield were as follows: ethanol concentration 70%, microwave power 200 W, material/liquid ratio 1:240 (g/mL) and extraction time 110 s. Under such conditions, a cordycepin yield of up to 9.228 mg/g was obtained. The developed analytical method exhibited mean recoveries ranging from 97.41% to 99.60% of 3 replicates for cordycepin in a real sample spiked at 3 levels and both high accuracy and precision so as to provide a convenient and cost saving method for the assay of cordycepin.

Key words：Cordyceps militaris；cordycepin；microwave-ultrasonic assisted extraction；UV spectrophotometry

蛹虫草又名北冬虫夏草、蛹草、蛹草菌、北虫草等，分类学上属于真菌门(Eumycota)、子囊菌亚门(Ascomycotinia)、核菌纲(Pyrenomycetes)、球壳目(Sphaeriales)、麦角菌科(Claviciptiaceae)、虫草属(Cordycps)，是极有开发价值的药、食两用滋补真菌[1-2]。虫草素即虫草菌素，早在1950年，由加拿大的Cunningham等[3]从蛹虫草的培养物中分离并鉴定出的，其结构与腺苷非常相似，所以又称为3＇-脱氧腺苷。后来Kaczka等[4]从无冠构巢曲霉(Aspergillus nidulans)中亦分离出这种物质，这是迄今在虫草属真菌以外唯一报道分离出虫草素的菌种。虫草素是第一个从真菌中分离出来的核苷类抗菌素[5]，虫草素具有免疫调节的作用[6]、抗肿瘤[7]、抗炎作用[8]、对尖音库蚊、埃及伊蚊和另一种伊蚊的幼虫有明显致死作用以及在治疗非洲人类锥虫病方面将发挥重要作用[9]等。对于虫草素的提取一般采取超声波提取、浸提法、索氏提取、回流法[10-16]、微波提取[17]等方法，目前尚未发现利用微波超声波协同提取虫草素的相关报道。而对于虫草素的检测，可以采用紫外、高效液相色谱、毛细管电泳等方法[14]，其中，紫外检测法较为方便、经济，为本研究的后续工作提供方便。鉴于此，就虫草素微波超声波协同提取工艺进行研究并评价紫外检测虫草素的准确度和精密度，以期更好地开发利用蛹虫草资源。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蛹虫草(Cordyceps militaris)13号菌株，由徐州工程学院食品工程学院实验室保存。

虫草素(高纯试剂) 中国药品生物制品检定所；甲醇(色谱纯) 天津市广成化学试剂有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

CW-2000超声波微波协同提取仪 上海新拓微波溶样测试技术有限公司；TU-1810紫外分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；HH.B11.600-S-Ⅱ型电热恒温培养箱 上海跃进医疗器械厂；HYG摇瓶柜 上海欣蕊自动化设备有限公司。

1.3 培养基

斜面培养基：SDAY培养基(葡萄糖4%、蛋白胨1%、酵母浸膏1%、琼脂2%)；液体培养基：葡萄糖4%、蛋白胨1%、酵母浸膏1%。

1.4 培养方法

斜面培养：将接种后的斜面于22℃培养7d；液体发酵培养：22℃、200r/min，培养5～7d。在250mL三角瓶中装入50mL发酵培养基，并将培养好的种子液按5%的接种量接种到发酵培养基中振荡培养。

1.5 蛹虫草菌株样品制备

从摇床培养机上取出培养好的13号虫草菌株，菌丝体结球颗粒均匀，4000r/min离心5min，弃上清液，剩下的固型物转移到灭过菌的培养皿里，置于冰箱冷冻。将冷冻好的样品放在真空冷冻干燥，干燥后研磨成粉，称其质量并做好标记。

1.6 虫草素的提取

1.6.1 超声波提取法

精确称取0.1250g蛹虫草菌粉5份，分别溶于50mL蒸馏水中，用超声波清洗机作用。超声提取时间分别为10、20、30、40、50min，提取后离心过滤，稀释定容至250mL。

1.6.2 微波提取法

精确称取0.1250g蛹虫草菌粉5份，分别溶于50mL蒸馏水中，选用微波-超声波协同提取仪中微波作用。先微波60s，功率分别为50、100、200、300、400W作用下，提取后离心过滤，稀释定容至250mL。

1.6.3 微波-超声波协同提取法

精确称取0.1250g蛹虫草菌粉5份，分别溶于50mL蒸馏水(若提取溶剂用乙醇，则需用旋转蒸发仪蒸发除去乙醇后再定容)，选用超声波-微波协同提取仪中微波和超声波协同作用。选择微波时间60s，功率分别为50、100、200、300、400W，超声波频率40kHz、功率50W，提取后离心过滤，稀释定容至250mL。

1.6.4 超声波-微波协同提取单因素试验

精确称取13号蛹虫草菌丝体0.1250g，按提取基本条件，分别考察乙醇体积分数10%、30%、50%、70%、90%；微波功率25、50、75、100、150、200、300、400W；微波时间30、50、70、90、110、130、150s；料液比1:120、1:160、1:200、1:240、1:280(g/mL)对虫草素含量的影响。

1.6.5 超声波-微波协同提取正交试验

在单因素试验的基础上，通过正交试验进一步考察乙醇体积分数、微波功率、微波时间和料液比之间的相互影响，并确定微波-超声波协同提取蛹虫草菌丝体中虫草素的最佳工艺参数。

1.7 分析检测方法

1.7.1 紫外分光光度法检测虫草素含量

精密称取10mg虫草素标准品，用超纯水溶解，用超声波清洗机加速溶解，稀释定容至100mL，制备成100mg/L标准储备液。利用100mg/L的虫草素母液，分别配制0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mg/L的虫草素溶液，紫外分光光度计全波段扫描1.0mg/L的虫草素标准品，在259nm波长处有最大吸收峰。以虫草素质量浓度(mg/L)为横坐标X，吸光度为纵坐标Y制作虫草素标准曲线见图1，则Y=0.0688X＋0.0128，R=0.9977。将提取好的样品测定其吸光度，根据标准曲线，计算虫草素的质量浓度。

图1 虫草素标准曲线Fig.1 Standard curve of cordycepin

1.7.2 虫草素含量计算

2 结果与分析

2.1 虫草素的定性检测

图2 虫草素光谱扫描曲线Fig.2 UV absorption spectra of cordycepin standard and sample

虫草素标准液和提取样品分别在紫外分光光度计190～490nm波长范围内扫描，在259nm处有最大吸收峰。由图2即可判定样品中含有虫草素。

2.2 最优提取方法的确定

表1 3种实验提取方法Table 1 Comparison among cordycepin yield from cultured mycelia of Cordyceps militaris extracted with the assistance of both microwave and ultrasonic or each of them

采用表1所示的3种方法提取虫草素，可以看出，虫草素含量最高的是微波-超声波协同提取法，对微波-超声波协同提取和微波提取的结果进行方差分析，T＝34.26＞t0.01＝4.604，表明在α＝0.01水平，两种提取方法有极显著性差异。这可能是由于在微波-超声波协同作用下，原料细胞部分被充分破坏，有效成分可很容易扩散到提取液中，加之微波振荡也可使原料颗粒加速运动，有利于扩散，提高溶液的温度，从而提高提取效果。

2.3 超声波-微波协同提取单因素试验

2.3.1 乙醇体积分数对虫草素含量的影响

图3 乙醇体积分数对虫草素含量的影响Fig.3 Effect of ethanol concentration on the cordycepin content in the extract solution

由图3可知，随着乙醇体积分数的增加，在乙醇体积分数为70%时提取的虫草素含量最大，故选择70%的乙醇作为提取虫草素的溶剂。

2.3.2 微波功率对虫草素含量的影响

图4 微波功率对虫草素含量的影响Fig.4 Effect of microwave power on the cordycepin content in the extract solution

采用70%的乙醇作为提取溶剂，微波作用时间为60s，由图4可以看出，随着微波功率的增加，物质的加热程度也增加，虫草素能够容易地被提取出来，在微波功率达到200W之后，虫草素含量开始递减，可能是功率太大，产热更快，使部分虫草素含量有所损失。故选用最佳微波功率为200W。

2.3.3 微波超声波协同作用时间对虫草素含量的影响

图5 超声时间对虫草素含量的影响Fig.5 Effect of exaction time on the cordycepin content in the extract solution

采用70%的乙醇作为提取溶剂，微波功率为200W，考察不同的微波超声波协同作用时间对虫草素含量的影响，结果见图5。微波作用时间为30s时，虫草素不能充分地转移到溶液中，随着时间的增加，虫草素含量增加，在50s时达到一个小峰值，继续增加时间，虫草素含量略有降低，可能是随着微波时间的增加，温度急剧升高，导致提取液部分挥发而使虫草素的含量有所损失，但随着时间的继续增加，虫草素含量又有个高的增幅，这就是超声波的作用效果。故选用最佳协同作用时间为110s。

2.3.4 料液比对虫草素含量的影响

图6 料液比对虫草素含量的影响Fig.6 Effect of material-to-liquid ratio on the cordycepin content in the extract solution

在乙醇体积分数、微波功率和协同提取时间分别为70%、200W和110s的条件下，采用不同的料液比对虫草素进行提取，结果见图6。从图中可以看出，随着提取溶液的增加，更有利于虫草素的溶出，可能是因为溶剂和原料间的浓度差越大，提取效率越高，目标物质越容易溶出，当料液比增加到1:200后，虫草素含量减少，表明提取基本完全。为节省后续处理时间和试剂，选择最佳料液比为1:200。

2.4 正交试验确定微波超声波提取虫草素的最佳条件

结合单因素试验结果，选择不同乙醇体积分数、微波功率、微波超声波协同作用时间及料液比为影响因素，选用L9(34)正交表进行试验，因素水平表见表2，正交试验结果见表3。由表3可知，各因素对虫草素含量的影响次序为D＞C＞B＞A，即料液比＞微波超声波协同作用时间＞微波功率＞乙醇体积分数，其最优方案为D3C2B2A2，即蛹虫草菌丝体以70%乙醇溶液为提取溶剂、料液比1:240(g/mL)、微波功率200W的条件下提取110s。但是由于最佳组合不在试验设计中，需做验证实验。

表2 正交试验因素水平表Table 2 Factors and levels in orthogonal array design

表3 正交试验结果与分析Table 3 Orthogonal array design matrix and corresponding experimental values of cordycepin yield

按照正交试验优选工艺D3C2B2A2和试验设计中的最优组合D3C2B1A2，平行3次，进行验证实验，D3C2B2A2工艺的虫草素含量平均达9.228mg/g，而D3C2B1A2工艺仅有8.757mg/g。通过差异显著分析，T＝4.554＞t0.05=2.776，表明在α＝0.05水平两种提取工艺有显著性差异，因此，最优提取工艺为D3C2B2A2。

2.5 测定方法的评价

2.5.1 紫外分光光度法测定回收率实验

将超声波微波协同提取最佳工艺提取的样液，定容至250mL，分别量取提取液1.5、2、2.5mL各3份，分别加入10mg/L标准工作液20、20、20、25、25、25、30、30、30μL。结果见表4。

表4 回收率实验Table 4 Mean recoveries of 3 replicates for cordycepin in a real sample spiked at 3 levels

从表4可以看出，本实验回收率为97.41%～99.60%，说明紫外测定的准确性较好，测定结果可信。

2.5.2 紫外分光光度法测定精密度实验

从10mg/L虫草素标准液中分别精密吸取1mL于10mL容量瓶中，用超纯水定容，在同一条件下重复测定6次，得出RSD为1.469%，表明紫外测定的精密度良好。

3 结 论

由于在交变电磁场的作用下，极性分子间的相互摩擦和碰撞更剧烈，增加了接触和反应的机会，迅速产生大量的热使细胞破裂，从而使微波有利于细胞中物质的提取。超声波通过在样品和溶剂之间产生的空穴作用，提高传质速率。微波和超声波的协同作用，充分发挥了两种提取方法的优点，所以提取效率比传统的方法高得多。

通过3种提取方法的比较得出：微波-超声波协同提取法比其他两种方法(微波法和超声波法)对虫草素的提取效果好，具有提取时间较短、提取效率高等优点。通过单因素试验和正交试验得出微波-超声波协同提取蛹虫草中虫草素的最佳条件为超声波40kHz、乙醇体积分数70%、微波功率200W、提取时间110s、料液比1:240(g/mL)。利用紫外分光光度法检测提取液中的虫草素含量，准确度和精密度都较高，较为方便、快捷。利用该方法可检测出低能离子束修饰蛹虫草菌株后虫草素的含量，选育得到了高产虫草素的菌株[18]。

[1] 邵力平. 真菌分类学[M]. 北京: 中国林业出版社, 1984: 109.

[2] NG T B, WANG H X. Pharmacological actions of Cordyceps, a prized folk medicine[J]. Journal of Pharmacy and Pharmacology, 2005, 57(12):1509-1519.

[3] CUNNINGHAM K G, MANSON W, SPRING F S, et al. Cordycepin,a metabolic product isolated from cultures of Cordyceps militaris (Linn.)Link.[J]. Nature, 1950, 166: 949.

[4] KACZKA E A, DULANEY E L, GITTERMAN C O. Isolation and inhibitory effects on KB cultures of 3＇-deoxyadenosine from Aspergillus nidulans wint[J]. Biochemical and Biophysical Research Communication,1964, 14(5): 452-455.

[5] SUGER A M, MCCAFFREY R P. Antifungal activity of 3＇-deoxyadenosine (cordycepin)[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1998, 42: 1424-1427.

[6] LI Jing, WANG Yan, MA Chuanrong, et al. Effect of cordycepin on inhibitting delayed type hypersensitivity[J]. Chin J Immunol, 2006, 22(5): 17-19.

[7] NAKAMURA K, YOSHIKAWA N, YAMAGUCHI Y. Antitumor effect of cordycepin (3＇-deoxyadenosine) on mouse melanoma and lung carcinoma cells involves adenosine A3 receptor stimulation[J]. Anticancer Res, 2006, 26(1A): 43-47.

[8] KIM H G, SHRESTHA B, LIM S Y, et al. Cordycepin inhibits lipopolysaccharide-induced inflammation by the suppression of NF -kappa B through Akt and p38 inhibition in RAW 264.7 macrophage cells[J]. Eur J Pharmacol, 2006, 545(223): 192-199.

[9] ROTTENBERG M E, MASOCHA W, FERELLA M. Treatment of African trypanosomiasis with cordycepin and adenosine deaminase inhibitiors in a mouse model[J]. J Infect Dis, 2005, 192(9): 1658-1665.

[10] 凌建亚, 孙迎节, 吕鹏, 等. 虫草属真菌中虫草素的超声波提取及其毛细管电泳测定[J]. 菌物系统, 2002, 21(3): 394-399.

[11] 王英娟, 李多伟, 王义潮, 等. 蛹虫草中虫草素、虫草多糖综合提取工艺研究[J]. 西北植物学报, 2005, 25(9): 1863-1867.

[12] 郭澄, 朱杰, 张纯, 等. 高效液相色谱法测定人工虫草菌丝中腺苷和虫草菌素的含量[J]. 中国中药杂志, 1998, 23(4): 632-633.

[13] 张嘉, 李多伟, 任静, 等. 正交试验提取虫草素的工艺研究[J]. 中国新医药, 2004, 3(2): 34-35.

[14] 刘春泉, 宋江峰, 李大婧, 等. 虫草素的提取纯化及测定方法研究进展[J]. 食品科学, 2007, 28(11): 596-599.

[15] 李刚, 朱华李, 毛先兵, 等. 蛹虫草中虫草素分离纯化工艺研究进展[J]. 重庆中草药研究, 2006(1): 51-54.

[16] 刘东泽, 陈伟, 高新华, 等. 虫草菌素(3-脱氧腺苷)研究进展[J]. 上海农业学报, 2004, 20(2): 89-93.

[17] 夏敏, 温鲁. 微波法提取虫草素研究[J]. 食品科学, 2006, 27(10): 248-251.

[18] 李文, 赵世光, 陈宏伟, 等. 低能离子束修饰蛹虫草菌株高产虫草素[J]. 生物工程学报, 2009, 25(11): 1725-1731.

Microwave-Ultrasonic Assisted Extraction of Cordycepin from Cultured Mycelia of Cordyceps militaris

WANG Tao，LI Wen，CHEN Hong-wei，CHEN Xiao-long，DIAO Jin-jin
(College of Food (Biology) Engineering, Xuzhou Institute of Technology, Xuzhou 221008, China)

Q939.96

A

1002-6630(2010)10-0086-05

2009-08-17

江苏省“六大人才高峰”资助项目；徐州工程学院校级重点课题(XKY2007103)

王陶(1976—)，男，讲师，博士，研究方向为离子束生物工程学和资源微生物学。E-mail：wangtaohf@126.com