超声波复合酶法提取桑黄多糖研究

谢丽源，王富伟，李洪军，甘炳成，彭卫红，谭 伟，黄忠乾

(1.西南大学食品科学学院，重庆 400716；2.四川农业科学院土壤肥料研究所，四川 成都 610066；3.四川农业大学资源环境学院，四川 雅安 625014)

超声波复合酶法提取桑黄多糖研究

谢丽源1,2，王富伟3，李洪军1，甘炳成2,*，彭卫红2，谭 伟2，黄忠乾2

(1.西南大学食品科学学院，重庆 400716；2.四川农业科学院土壤肥料研究所，四川 成都 610066；3.四川农业大学资源环境学院，四川 雅安 625014)

采用单因子分析和正交试验，以桑黄菌丝体提取物中多糖得率为指标，对超声波复合酶法中影响多糖提取效果的主要因素进行研究。结果表明：超声波提取优化工艺条件为超声处理时间20min、料液比1:25(g/mL)、功率500W，在此基础上提取多糖得率为3.356%，在超声波优化结果基础上，进一步进行复合酶法处理，酶解最佳提取条件是pH6.5，酶解温度50℃，纤维素酶添加量2.5%、果胶酶添加量2.5%、蛋白酶添加量1%，酶解时间120min，多糖得率为6.619%，由此可见，超声波和复合酶法双重处理提取桑黄多糖是一种有效的提取方法，适合大规模生产运用。

桑黄；多糖；超声波；复合酶；正交试验

Abstract ：To develop an optimal procedure based on ultrasonic pretreatment followed by enzymatic hydrolysis for the extraction of polysaccharides from the fermented mycelia of Phellinus linteus, single factor and orthogonal array design methods were used to deal with the effects of crucial ultrasonic pretreatment and hydrolysis parameters on polysaccharide yield. Results showed that the optimization of ultrasonic pretreatment led to 3.356% polysaccharide yield, in which, the optimal values of ultrasonic power, pretreatment time and material/liquid ratio were determined to be 500 W, 20 min and 1:25 (g/mL), respectively.The optimization of enzymatic hydrolysis leading to 6.619% polysaccharide yield was achieved through the combinatorial use of cellulase at 2.5% dosage, pectinase at 2.5% dosage and neutral proteinase at 1% dosage for the hydrolysis for 120 min at pH 6.5 and 50 ℃. The combination of ultrasonic pretreatment and enzymatic hydrolysis may provide a good idea for the large-scale production of polysaccharides from the fermented mycelia of Phellinus linteus.

Key words：Phellinus linteus；polysaccharide；ultrasonic；compound enzyme；orthogonal test

桑黄是一种珍稀的药用真菌[1]。医学表明，具有抗肿瘤、抗氧化、抗肝纤维化、增强免疫等药理活性[2-7]，被国际公认为抗肿瘤效果最好的药用真菌之一。与大多数药用真菌一样，桑黄水提物的主要活性成分是多糖，而多糖是构成真菌细胞壁的主要成分，与纤维素、蛋白质等紧密联结，不易分离。常用的热水提取方法，耗时长，多糖得率低[8]。

近年来，随着超声波技术被广泛的应用于真菌、植物组织中活性物质的提取，不少研究人员也将其运用于真菌多糖的提取[9-10]，但得率仍不够理想。酶解技术有着反应条件温和、周期短、成本低等优势被运用到真菌多糖提取中的研究也有报道[11-12]，但是所用的酶大多为纤维素酶。将超声波复合酶酶解技术运用到桑黄多糖提取的报道比较少见。本研究采用超声波和复合酶法处理技术对桑黄多糖进行提取，即先进行超声波处理，再进行复合酶解，并优化提取的最佳条件，旨在最大限度提高多糖得率，为桑黄多糖的产业化提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

桑黄(Phellinus linteus)菌株10＃，由四川省农业科学院微生物研究中心提供，菌株在50L发酵罐发酵，收获菌体。

98%浓硫酸、95%乙醇、果胶酶(酶活力7×104U/g)成都市科龙化工试剂厂；纤维素酶(酶活力15U/mg) 上海伯奥生物科技有限公司；中性蛋白酶(酶活力6×104U/g)北京奥博星生物技术有限责任公司；苯酚、氯仿、正丁醇均为国产分析醇。

R-201旋转蒸发器 上海申胜生物技术有限公司；JY92-ⅡDN超声波细胞粉碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司；PHS-3C pH计 上海康仪仪器有限公司；GLI66-Ⅱ高速离心机 上海安亭科学仪器厂；紫外分光光度计 日本岛津公司。

1.2 方法

1.2.1 提取工艺

将桑黄菌丝体60℃烘干，研磨成粉末状过60目筛备用。

1.2.2 多糖含量测定

采用苯酚-硫酸比色法[13]。

1.2.3 多糖得率计算

1.2.4 超声波处理条件优化

1.2.4.1 超声时间对多糖得率的影响

准确称量1g菌丝体，按料液比1:30(g/mL)加蒸馏水，在功率300W条件下，超声时间分别按10、15、20、25min处理，测定多糖含量及计算得率。实验设3个重复。

1.2.4.2 料液比对多糖得率的影响

准确称量1g菌丝体，在功率300W条件下，处理时间按第一步最佳得率确定，料液比分别按1:20、1:25、1:30、1:35、1:40处理，测定多糖含量及计算得率。

1.2.4.3 超声功率对多糖得率的影响

准确称量1g菌丝体，处理时间和料液比分别按1.2.4.1节和1.2.4.2节最佳得率处理，功率分别按100、200、300、400、500W处理，测定多糖含量及计算得率。

1.2.4.4 超声波正交试验

在单因素试验的基础上，采用正交试验对影响提取的因素如时间、料液比及功率进行条件优化。

1.2.5 复合酶处理条件优化

1.2.5.1 酶解时间对多糖得率的影响

纤维素酶、果胶酶、蛋白酶组成的复合酶均在添加量2%、温度45℃、pH6.5，酶解时间分别按40、60、80、100、120min处理，测定多糖含量及计算得率。

1.2.5.2 pH值对多糖得率的影响

纤维素酶、果胶酶、蛋白酶组成的复合酶均在添加量2%、温度45℃、1.2.5.1节确定的最佳酶解时间，pH值分别按4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5处理，测定多糖含量及计算得率。

1.2.5.3 温度对多糖得率的影响

纤维素酶、果胶酶、蛋白酶组成的复合酶均在添加量2%，1.2.5.1节和1.2.5.2节确定的最佳条件，温度分别按35、40、45、50、55、60℃处理，测定多糖含量及计算得率。

1.2.5.4 复合酶法正交试验

在超声波后复合酶解单因素试验的基础上，用正交试验对影响提取的因素：酶解时间、复合酶添加量、pH值及酶解温度进行条件优化。

2 结果与分析

超声波复合酶法提取多糖全过程为超声波处理和复合酶酶解两个阶段，这两个阶段都很重要。第一阶段是通过超声波空化效应对原料的破碎作用，使不易被浸出细胞壁的化学成分和溶剂充分接触；第二阶段是在超声波处理后再通过复合酶解细胞表面结构及胞间连接物，使溶于水的胞内多糖浸出率增加。

2.1 超声波法处理条件优化

2.1.1 超声处理时间对多糖得率的影响

图1 不同超声时间对多糖得率的影响Fig.1 Effect of ultrasound treatment time on polysaccharide yield

由图1可以看出，随着超声处理处理时间延长，细胞破碎程度增大，内部的多糖物质便开始溶出，多糖得率开始升高，当超声时间为 20min时达到最大值，随后开始回落。这是由于随着超声处理时间的继续延长，空化效应的作用力减小，使得桑黄颗粒表面对提取的物质吸附力增强，多糖得率有所下降。另外，超声处理时间过长，多糖结构可能被破坏，也是造成多糖含量下降的原因。

2.1.2 料液比对多糖得率的影响

图2 不同料液比对多糖得率的影响Fig.2 Effect of material/liquid ratio on polysaccharide yield

由图2所示，在料液比1:25时多糖得率最高，随着料液比的减小多糖得率降低，这是由于减小料液比减弱了能量的传递效果，细胞壁未得到充分的破碎，多糖溶出机率减小所致。

2.1.3 超声功率对多糖得率的影响

图3 不同超声功率对多糖得率的影响Fig.3 Effect of ultrasonic power on polysaccharide yield

由图3所示，随着超声功率的增大，多糖得率逐渐提高，当功率为300W时达到最大，然后多糖得率开始下降，原因可能是伴随着功率的增大，产生的冲击波、剪切力迫使细胞壁破碎，多糖得率增加，但随着功率的进一步提高，多糖的结构被破坏的可能性也大大增加，导致含量下降。

2.1.4 超声波法正交试验

在单因素试验的基础上，采用正交表L9(34)对影响提取的因素：超声时间、料液比及超声功率进行条件优化。因素水平设计见表1。

表1 超声波法正交试验因素和水平Table 1 Factors and levels in the orthogonal array design for the optimization of ultrasonic pretreatment

表2 超声波法正交试验结果Table 2 Experimental results of orthogonal array design for the optimization of ultrasonic pretreatment

表3 超声波法正交试验方差分析Table 3 Variance analysis for polysaccharide yield with various ultrasonic pretreatment conditions

正交试验结果见表2。极差R和方差分析表明，影响多糖得率的主次顺序是C＞A＞B，B因素各水平达到显著水平，C达到极显著水平，最佳水平因素组合是A2B2C3，即超声时间20min、料液比1:25、超声功率500W，在此条件得到的多糖得率为3.356%。但实际多糖含量远高于上述方法得到的多糖含量，为达到更好的提取效果，在此条件优化的基础上，继续进行复合酶处理。

2.2 超声波后复合酶酶解条件优化

2.2.1 超声波后酶解时间对多糖得率的影响

图4 不同酶处理时间对多糖得率的影响Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis time on polysaccharide yield

从图4可以看到，随着酶解时间的增加多糖得率逐渐增大，100min时达到一个最大值，当酶解时间超过100min后，酶解基本完全，随时间的延长，多糖得率提高缓慢。

2.2.2 超声波后pH值对多糖得率的影响

从图5可以看出，随着pH值的增大多糖得率增大，酶解的最适pH值在6附近，大于6以后多糖提取开始下降，由于酶对pH值比较敏感，pH值的变化可以改变酶空间构象而引起酶活性的降低。

2.2.3 超声波后酶解温度对多糖得率的影响

图6 不同酶解温度对多糖得率的影响Fig.6 Effect of hydrolysis temperature on polysaccharide yield

从图6可以看出，复合酶的最适温度在45℃，多糖得率最高，温度进一步升高，多糖得率降低。这是因为温度升高，反应速度加快，多糖得率增加，但是酶本身也是一种蛋白质，温度过高时因变性而失去活性，导致多糖得率降低。

2.2.4 复合酶法正交试验

为进一步考察单因素对结果的综合影响，根据单因素试验确定的条件范围，设计L18(37)正交试验对影响提取的因素如酶解时间、酶解pH值、酶解温度及复合酶酶量进行条件优化。因素水平设计见表4。

表4 超声波酶法正交试验因素和水平Table 4 Factors and levels in the orthogonal array design for the optimization of enzymatic hydrolysis

表5 超声波酶法正交试验结果Table 5 Experimental results of orthogonal array design for the optimization of enzymatic hydrolysis

复合酶法正交试验结果和方差分析见表5和表6。由极差R分析表明，影响多糖得率的主次顺序依次是E＞D＞C＞B＞A＞F，酶解温度、纤维素酶添加量、pH值因素水平差异对多糖得率的影响达到极显著水平，蛋白酶添加量达到显著水平，最佳水平因素是A3B1C3D3E3F3，即果胶酶添加量2.5%、蛋白酶添加量1%、纤维素酶添加量2.5%、酶解温度50℃、pH6.5、酶解时间120min，此条件下多糖得率为6.619%。由此结果可知，超声波和复合酶双重处理提取桑黄多糖，得率较仅用超声波处理(多糖得率3.356%)有很大提高，由此可见，在用超声波处理后，有进一步用复合酶酶解的必要。

表6 超声波酶法正交试验方差分析Table 6 Variance analysis for polysaccharide yield with various enzymatic hydrolysis conditions

3 讨 论

由于真菌多糖自身的药用价值，因此在医药和保健品领域得到越来越多的广泛应用，提取技术是真菌多糖能否大规模运用的关键。通过单因素试验和正交试验，确定超声波提取桑黄多糖的最佳条件为超声时间20min、功率500W、料液比1:25，在此条件下多糖得率为3.356%；在超声波处理基础上继续进行复合酶酶解，其提取最佳条件为果胶酶添加量2.5%、蛋白酶添加量1%、纤维素酶添加量2.5%、酶解温度50℃、pH6.5、酶解时间120min，在此条件下多糖得率可达到6.619%。由此可见，超声波复合酶提取多糖得率的两个阶段对多糖得率的影响均非常重要，是值得借鉴的一种桑黄多糖提取方法。这是由于在整个超声处理过程中，超声波的空化效应虽然能增加对原料的破碎效果，增加多糖溶出率，但是它不能完全的将细胞壁破碎，而酶的加入弥补这一缺陷，对细胞壁进行进一步的酶解，多糖溶出几率越大。

超声波是以一种机械的方法将细胞壁破碎，而酶解虽然温和，两者难免都会对溶出的多糖在结构上有一定的破坏，进而影响多糖的结构、生物活性等。因此超声波法、超声波复合酶法与热水浸提法提取的桑黄多糖在多糖组分、生物活性、结构等方面有没有差异，何种差异尚待进一步研究。

[1] 刘波. 中国药用真菌[M]. 太原: 山西人民出版社, 1974: 71-73.

[2] 温克, 陈劲, 李红, 等. 桑黄等四种抗癌药物抗癌活性比较[J]. 吉林大学学报: 医学版, 2002, 28(3): 247-249.

[3] SHON Y H, NAM K S. Antimutagenicity and induction of anticarcinogen is phase Ⅱ enzymes by basidiomycetes[J]. Journal of Ethnopharmacology,2001, 77(1): 103-109.

[4] KIM G Y, KIM S H, HWANG S Y, et al. Oral administration of proteoglycan isolated from Phellinus linteus in the prevention and treatment of collagen-induced arthritis in mice[J]. Biological and Pharmaceutical Bulletin, 2003, 26(6): 823-83l.

[5] HAN S B, LEE C W, JEON Y J, et al. The inhibitory effect of polysaccharides isolated from Phellinus linteus on tumor growth and metastasis[J]. Immunopharmacology, 1999, 41(2): 157-164.

[6] 张万国, 胡晋红. 桑黄预防大鼠肝纤维化作用的实验研究[J]. 药学服务与研究, 2002, 2(2): 82-84.

[7] 张万国, 胡晋红, 蔡溱, 等. 桑黄抗大鼠肝纤维化与抗脂质过氧化[J].中成药, 2002 , 24(4): 281-283.

[8] 郭树凡, 张慧丽, 李昱, 等. 桑黄子实体多糖提取条件的研究[J]. 食用菌学报, 2006(4): 49-52.

[9] 刘安军, 陈伟伟, 王稳航, 等. 桑黄(Phellinus linteus)水溶多糖提取技术研究[J]. 食品研究与开发, 2006(10): 32-35.

[10] 郭树凡, 蔡天革, 李辉, 等. 微波辅助提取桑黄多糖的工艺研究[J].特产研究, 2008(1): 22-25.

[11] 马春, 董秀萍, 朱蓓薇. 复合酶法提取姬松茸胞内多糖[J]. 大连轻工业学院学报, 2005(3): 195-198.

[12] 沈爱英, 谷文英. 复合酶法提取姬松茸子实体多糖的研究[J]. 食用菌, 2001(3): 7-9.

[13] 徐志祥, 李刚, 李宝建. 苯酚-硫酸法测定灵芝多糖含量的条件研究[J]. 食用菌, 2000, 22(3): 6-7.

Ultrasonic Pretreatment Followed by Enzymatic Hydrolysis for Extraction of Polysaccharides from Fermented Mycelia of Phellinus linteus

XIE Li-yuan1,2，WANG Fu-wei3，LI Hong-jun1，GAN Bing-cheng2,*，PENG Wei-hong2，TAN Wei2，HUANG Zhong-qian2
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400716, China；2. Institute of Soil and Fertilizer, Sichuan Academy of Agricultural Sciences, Chengdu 610066, China；3. College of Resources and Environment, Sichuan Agricultural University,Ya’an 625014, China)

R284.2

A

1002-6630(2010)10-0081-05

2009-07-27

四川省青年基金项目(2008ZQ026-072)；四川省科技支撑计划项目(2008FZ0157)；四川省财政育种工程四川省农科院青年基金项目(2007QNJJ-015)

谢丽源(1977—)，女，助理研究员，博士研究生；研究方向为农产品加工。E-mail：xieliyuan77@163.com

*通信作者：甘炳成(1968—)，男，研究员，硕士，研究方向为微生物及农产品加工。E-mail：bgan918@163.com