羊软骨Ⅱ型胶原蛋白对小鼠佐剂性关节炎抑制作用的研究

刘 媛，王 健，史忠林，张志胜

(1.河北北方学院食品科学系，河北 张家口 075000；2.河北农业大学食品科技学院，河北 保定 071001)

羊软骨Ⅱ型胶原蛋白对小鼠佐剂性关节炎抑制作用的研究

刘 媛1，王 健1，史忠林1，张志胜2

(1.河北北方学院食品科学系，河北 张家口 075000；2.河北农业大学食品科技学院，河北 保定 071001)

目的：探讨灌胃Ⅱ型胶原蛋白(CⅡ)对佐剂性关节炎小鼠体质量和足底厚度的影响。方法：通过预实验，筛选出0.2mol/L CⅡ的最佳灌胃剂量为0.6mL/d；然后将小鼠随机分为4组：正常组、预防组、治疗组和模型组进行正式实验；最后测定致炎前后不同时期各组小鼠的体质量和足底厚度。结果：预防组和治疗组小鼠体质量呈先减少后增加趋势，小鼠足底厚度分别从致炎12d和14d后呈明显降低趋势，且前者效果优于后者，模型组小鼠致炎后体质量增长受到抑制且足底厚度明显增加。结论：灌胃羊软骨CⅡ能明显缓解佐剂性关节炎小鼠的炎症反应。

羊软骨；Ⅱ型胶原蛋白；佐剂性关节炎；抑制作用

Abstracts ：Objective: To investigate the effect of intragastric administration of collagen II from sheep cartilage on the body weight and plantar thickness in mice with adjuvant arthritis. Methods: The optimal dosage of collagen II was screened using preliminary experiments. Mice were randomly divided into four groups, designated as control group (A), prevention group (B),treatment group (C) and model group (D). The body weight and plantar thickness in mice were measured at different time points before and after induction of inflammation. Results: The plantar thicknesses of groups B and C both began to markedly decrease from 12 and 14 days after inflammatory induction, respectively; the change trend of body weight initially decreased, followed by an increase. Group B was superior to group C in body weight recovery. However, body weight was inhibited but plantar thickness increased significantly after inflammatory induction in group D. Conclusion: Intragastric administration of collagen II can relieve inflammatory reaction in mice with adjuvant arthritis.

Key words：sheep cartilage；type II collagen；adjuvant arthritis；inhibition

胶原蛋白是人体组织中含量最丰富的蛋白之一，共分为19型。其中Ⅱ型胶原蛋白(typeⅡcollagen，CⅡ)在人和动物的软骨中含量最为丰富[1]，是透明软骨的主要结构性组分，许多软骨性疾病的发生、发展都与CⅡ的结构或功能异常密切相关，因此，CⅡ成为类风湿性疾病研究中的热点[2-4]。最为经典、最为常用的类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)实验模型[5]是弗氏完全佐剂诱导的佐剂性关节炎(adjuvantarthritis，AA)，常用于其发病机制的研究[6]。

国外学者[7-8]对灌胃CⅡ防治AA、Pristane关节炎、抗原性关节炎的作用进行了研究，实验发现致炎前和致炎后灌胃CⅡ(5、50、500μg/kg bw·d，灌胃7d)均能减轻佐剂性关节炎(adjuvantarthritis，AA)大鼠的炎症程度，致炎前给药的作用好于致炎后给药。国内学者也证实了口服鸡源和牛源C Ⅱ能明显减轻患鼠关节肿胀度，降低AA发病率，但对羊源C Ⅱ的预防和治疗效果研究较少[9-10]。本实验采用预防和治疗两种方案灌胃羊软骨CⅡ，测定致炎前后不同阶段小鼠体质量和足底厚度的变化趋势，研究对小鼠AA抑制作用的影响。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

KM系雄性小鼠(合格证号：8010078)，6周龄，160只，体质量20g左右，购于河北省试验动物中心；新鲜羊肋软骨 保定市肉联厂。

盐酸胍 天津市福晨化学试剂厂；胃蛋白酶、Ⅱ型胶原蛋白标准样品(鸡剑状软骨) Sigma公司。

旋风牌微型高速万能试样粉碎机 河北省黄骅市齐家务振兴电器厂；LRH-1508生化培养箱 广东省医疗器材厂；TGL-16G高速台式冷冻离心机 上海安亭科学仪器厂；JJ-1增力电动搅拌器 金坛市恒丰仪器厂；ZK-82B真空干燥箱 上海实验仪器总厂；DYCZ-24D双垂直电泳槽、DYY-Ⅲ2稳压稳流电泳仪 北京市六一仪器厂；Delta320酸度计 梅特勒-托利多仪器上海公司；UV751GD 紫外-可见光分光光度计 上海光明医疗仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 羊软骨CⅡ的制备[11-12]

对羊软骨进行去除骨筋膜等前处理，再用盐酸胍抽提蛋白多糖(每克软骨加入10mL 4mol/L盐酸胍)，在pH2.5～3、胃蛋白酶质量浓度10mg/100mL的条件下进行酶解，最后过夜盐析，离心(10000r/min，4℃离心30min)所得絮状沉淀即为CⅡ，纯度为93.12%。SDSPAGE电泳结果显示自提CⅡ与标准品结果一致。使用前将所提CⅡ溶解，配成0.2mol/L的中性溶液。

1.2.2 预实验

取100只体质量20g左右的KM系小鼠，进行灌胃0.2mol/L CⅡ的剂量筛选实验。结果表明0.6mL/d为最佳灌胃剂量[13]，采用该剂量进行正式实验。

1.2.3 正式实验

再取60只小鼠随机分为4组：对照组、预防组、治疗组、模型组，每组设15个重复。每组除正常饲喂外，对照组每天灌胃生理盐水，第31天于小鼠右(左)后足跖部注射生理盐水0.1mL；预防组每天灌胃0.6mL CⅡ，第31天于小鼠右(左)后足跖部注射完全弗氏佐剂0.1mL诱导小鼠致炎；治疗组前30天每天灌胃生理盐水，第31天再对小鼠以同样方法致炎，致炎后每天灌胃0.6mL C Ⅱ；模型组第31天同样方法致炎，全程每天灌胃生理盐水。

1.2.4 指标检测

小鼠体质量的测定：于致炎前12h，致炎后第3、10、18、24天分别测定各组小鼠的体质量。

小鼠足底厚度的测定：于致炎前12h，致炎后第6、12、14、18、24天分别测定各组小鼠左右足的足底厚度。

1.2.5 数据分析

本试验采用单因素四水平设计，采用SPSS软件包的 Paired-Samples t Test程序，数据以±s表示。

2 结果与分析

2.1 灌胃CⅡ对小鼠体质量的影响

表1 正式实验全程小鼠体质量变化情况Table 1 Change trend of body weight from 12 hours before until 24 days after inflammatory induction

由表1可见，对照组变化幅度不明显；预防组在致炎后3d呈缓慢增加趋势；治疗组开始变化不明显，在致炎后10d体质量呈明显增加趋势；模型组呈先减少后缓慢恢复的变化趋势。在实验期末，预防组体质量显著高于其他3组，治疗组显著高于模型组，模型组明显低于其他3组，说明致炎严重抑制小鼠的体质量增长；预防组和治疗组对小鼠体质量的恢复均有促进作用，并且前者效果更明显。

2.2 灌胃CⅡ对小鼠足底厚度的影响

图1 各阶段小鼠右足底厚度变化趋势Fig.1 Change trend of right foot plantar thickness from 12 hours before until 24 days after inflammatory induction

图2 各阶段小鼠左足底厚度变化趋势Fig.2 Change trend of left foot plantar thickness from 12 hours before until 24 days after inflammatory induction

由图1可见，小鼠右足(原发性炎症一侧)变化趋势：对照组变化幅度很小；预防组在致炎后12d开始有降低趋势，直到14d后趋于平稳，24d恢复正常；治疗组在致炎后14d开始有降低趋势，直到24d后恢复正常。由图2可见，左足(继发性炎症一侧)变化趋势与右足大致相同；模型组原发性一侧致炎后显著升高，18d后略有下降；继发性一侧变化不明显。

3 讨 论

RA主要侵犯身体各部位的大小关节，以小关节受损为主，致残率高。RA的病因及发病机制十分复杂，迄今尚未完全阐明，可能涉及到遗传、感染、免疫功能失调、内分泌紊乱等诸多因素。为了能够深入研究RA发病机制和评价药物疗效，常需借助于建立一个动物模型来进行。目前虽有多种制备动物模型的方法，如卵蛋白诱导的关节炎、MRL/Ipr小鼠自发性关节炎、TNF-α基因转化动物关节炎等，但是这些方法都有成功率低、模型建立时间长等缺点[14]。因此，本实验采用完全弗氏佐剂，制造小鼠佐剂性关节炎动物模型，并取得了良好的造模效果。

CⅡ作为一种自身抗原，在RA的发病过程中起重要作用。国外学者曾用鸡肋软骨来源的CⅡ对RA动物模型和人类RA进行了实验性治疗研究和初步临床观察，并取得了一定疗效[15]。本实验采用预防和治疗两种方案对AA小鼠灌胃羊软骨CⅡ，通过观察小鼠足底厚度和体质量的变化，研究CⅡ对小鼠佐剂性关节炎的抑制作用。小鼠足底厚度能间接反映致炎小鼠膝关节的肿胀度，实验结果表明，灌胃羊软骨CⅡ能明显缓解AA小鼠的关节肿胀度，且预防组效果优于治疗组。致炎后小鼠的体质量增长受到严重抑制，预防组和治疗组对小鼠体质量的恢复均有促进作用，并且前者效果更明显。

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Inhibitory Effect of Type II Collagen from Sheep Cartilage on Adjuvant Arthritis in Mice

LIU Yuan1，WANG Jian1，SHI Zhong-lin1，ZHANG Zhi-sheng2
(1. Department of Food Science, Hebei North University, Zhangjiakou 075000, China；2. College of Food Science and Technology, Agricultural University of Hebei, Baoding 071001, China)

TS201.2

A

1002-6630(2010)15-0268-03

2009-12-23

刘媛(1981—)，女，讲师，硕士，主要从事功能性食品的研究与开发。E-mail：liuyuanwenwen1981@126.com