顺磁共振测定姜油树脂的DPPH自由基清除率

2010-09-13葛庆丰宋明军

食品科学 2010年15期

关键词：姜辣素波谱信号强度

葛庆丰，宋明军，顾林*

(扬州大学食品科学与工程学院，江苏扬州 225127)

顺磁共振测定姜油树脂的DPPH自由基清除率

葛庆丰，宋明军，顾林*

(扬州大学食品科学与工程学院，江苏扬州 225127)

应用电子顺磁共振(ESR)方法测定姜油树脂对DPPH自由基的清除效果，结果表明：当姜油树脂中姜辣素与DPPH自由基的物质的量比达到2.0时，5min后就检测不出DPPH自由基；姜辣素与DPPH自由基物质的量比为0.25时，可以清除50%的DPPH自由基。

电子顺磁共振；姜油树脂；DPPH自由基清除率

Abstract ：This study investigated the use of ESR for measuring the scavenging effect of gingerol oleoresin on DPPH free radicals.DPPH free radicals could not be detected after 5 min exposure to half molar amount of gingerol, an antioxidant component contained in gingerol oleoresin. The percentage of scavenged DPPH free radicals was 50% when the molar ratio of gingerol to DPPH free radicals was 1:4.

Key words：ESR；ginger oleoresin；scavenging rate of DPPH free radicals

自由基是一类具有高度活性，含有未配对电子的物质[1]，能致细胞和细胞膜过氧化损伤，进一步导致细胞膜功能丧失，是产生疾病的主要原因[2]。随着自由基引起人们的关注，其天然提取抗氧化物质清除自由基成为研究热点。判定物质清除自由基能力的常用方法有分光光度法、电子顺磁共振波谱法等。

电子顺磁共振(electron spin resonance，ESR)，此方法制样简单、检测方便、快捷、灵敏度很高。DPPH自由基是一种很稳定的以氮为中心的自由基，有个单电子，在515nm波长处有强吸收，其乙醇溶液呈深紫色，清除剂通过与单电子配对使其颜色逐渐消失。参照文献[3-4]知，DPPH自由基法测定的机理一般认为是DPPH自由基使待测的有机成分形成不稳定的自由基中间体，进而双分子偶联，形成稳定的最终产物。

有害物质进一步对细胞造成伤害，从而导致疾病、癌症、衰老。连锁起始阶段和连锁成长阶段会产生许多自由基，具有清除各种自由基能力的物质称为自由基清除型抗氧化剂。在生成的有害物质对细胞造成伤害后起到修复再生作用的，被称为该物质具有修复再生机能，该作用主要通过对总抗氧化能力的测定来证明。

生姜中辣味成分具有很强的抗氧化活性[5-7]。姜辣素是生姜中重要的抗氧化成分，它具有显著的抗氧化作用。生姜抗氧化剂具有良好的热稳定性，安全性强，有芳香味，可广泛应用于油脂、肉制品等食品中。因此，它是一种值得研究开发的天然抗氧化剂[8]。

本实验法对姜辣素进行体外抗氧化活性实验。通过清除DPPH自由基的实验来测定在自由基连锁起始反应阶段是否具有抑制作用。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

姜油树脂实验室自制[9]。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) Sigma公司；无水乙醇(AR) 上海振兴化工一厂。

A300-10/12电子顺磁共振波谱仪德国Bruker公司.

1.2 方法

1.2.1 ESR操作参数的设置

使用A-300 EPR波谱仪，谐振腔为HSC(ER 4119)，频率为X波段。扫场宽度100.000G，中心磁场3519.960G，微波频率9.874GHz，测试温度297K，调制频率100.000kHz，调制幅度2.000G，微波功率20.104mW，时间常数327.680ms，扫场时间665.600s。

1.2.2 DPPH自由基的清除实验[10]

用无水乙醇先配1×103mol/L DPPH母液，于棕色瓶中避光低温保存备用，用时取DPPH母液稀释为2×104mol/L。在50 μL毛细管中装入DPPH溶液，放入谐振腔固定好，记录EPR谱信号强度(I0)，并计算峰面积(S0)。然后，在毛细管中加入提取液，迅速混匀，放入谐振腔固定好，记录EPR谱信号强度(Ix)，并计算峰面积(Sx)。按下式计算DPPH自由基的剩余率。

2 结果与分析

2.1 DPPH自由基的清除效果

姜辣素与DPPH自由基的物质的量比为0.02时，测定姜辣素清除DPPH自由基的效果，获得电子顺磁共振波谱图见图1。

由图1可知，随着时间的延长，信号下降缓慢，5min后没有较大的变化，说明姜辣素与DPPH自由基的物质的量比为0.02时对DPPH自由基清除效果较差。

姜辣素与DPPH自由基的物质的量比为0.2时，测定姜辣素清除DPPH自由基，获得电子顺磁共振波谱图见图2所示。

由图2可知，5min后信号强度约减弱一半，随后没有变化，与图1比较，姜辣素与DPPH自由基的物质的量比为0.2时对DPPH自由基清除有明显的效果。

姜辣素与DPPH自由基的物质的量比为0.5时，测定姜辣素清除DPPH自由基，获得电子顺磁共振波谱图见图3所示。

由图3可知，随着时间的延长，信号强度逐渐减弱，与图2比较，说明姜辣素与DPPH自由基的物质的量比为0.5时对DPPH自由基清除效果较好。

图1 姜辣素与DPPH自由基物质的量比为0.02时清除DPPH自由基电子顺磁共振波谱Fig.1 EPR spectra of DPPH free radicals after exposure to gingerol (at a molar ratio of gingerol to DPPH free radicals of 0.02:1) for different periods of time

图2 姜辣素与DPPH自由基物质的量比为0.2时清除DPPH自由基电子顺磁共振波谱Fig.2 EPR spectra of DPPH free radicals after exposure to gingerol (at a molar ratio of gingerol to DPPH free radicals of 0.2:1) for different periods of time

图3 姜辣素与DPPH自由基物质的量比为0.5时清除DPPH自由基电子顺磁共振波谱Fig.3 EPR spectra of DPPH free radicals after exposure to gingerol (at a molar ratio of gingerol to DPPH free radicals of 0.5:1) for different periods of time

图4 姜辣素与DPPH自由基物质的量比为0.8时清除DPPH自由基电子顺磁共振波谱Fig.4 EPR spectra of DPPH free radicals after exposure to gingerol (at a molar ratio of gingerol to DPPH free radicals of 0.8:1) for different periods of time

图5 姜辣素与DPPH自由基物质的量比为1.0时清除DPPH自由基电子顺磁共振波谱Fig.5 EPR spectra of DPPH free radicals after exposure to gingerol (at a molar ratio of gingerol to DPPH free radicals of 1.0:1) for different periods of time

姜辣素与DPPH自由基的物质的量比为0.8时，测定姜辣素清除DPPH自由基，获得电子顺磁共振波谱图见图4所示。

由图4可知，随着时间的延长，信号强度逐渐减弱，到25min后信号强度较弱，与图3比较，说明姜辣素与DPPH自由基的物质的量比为0.8时对DPPH自由基清除效果较好。

姜辣素与DPPH自由基物质的量比为1.0时，测定姜辣素清除DPPH自由基，获得电子顺磁共振波谱图见图5所示。

由图5可知，随着时间的延长，信号强度逐渐减弱，到25min后信号强度较弱，与图4比较，说明姜辣素与DPPH自由基的物质的量比为1.0时对DPPH自由基清除效果较好。

姜辣素与DPPH自由基的物质的量比为1.2时，测定姜辣素清除DPPH自由基，获得电子顺磁共振波谱图见图6所示。

由图6可知，5min时信号强度下降的很明显，随后信号强度逐渐减弱，到25min后信号强度较弱，与图5比较，说明姜辣素与DPPH自由基的物质的量比为1.2时对DPPH自由基清除效果较好。

姜辣素与DPPH自由基的物质的量比为1.5时，测定姜辣素清除DPPH自由基，获得电子顺磁共振波谱图见图7所示。

由图7可知，5min时信号强度下降的很明显，随后信号强度逐渐减弱，到25min后信号强度较弱，与图6比较，说明姜辣素与DPPH自由基的物质的量比为1.5时对DPPH自由基清除效果较好。

姜辣素与DPPH自由基的物质的量比为2.0时，测定姜辣素清除DPPH自由基，获得电子顺磁共振波谱图

图6 姜辣素与DPPH自由基物质的量比为1.2时清除DPPH自由基电子顺磁共振波谱Fig.6 EPR spectra of DPPH free radicals after exposure to gingerol (at a molar ratio of gingerol to DPPH free radicals of 1.2:1) for different periods of time

图7 姜辣素与DPPH自由基物质的量比为1.5时清除DPPH自由基电子顺磁共振波谱Fig.7 EPR spectra of DPPH free radicals after exposure to gingerol (at a molar ratio of gingerol to DPPH free radicals of 1.5:1) for different periods of time

图8 姜辣素与DPPH自由基物质的量比为2.0时清除DPPH自由基电子顺磁共振波谱Fig.8 EPR spectra of DPPH free radicals after exposure to gingerol (at a molar ratio of gingerol to DPPH free radicals of 2.0:1) for different periods of time

由图8可知，5min时已没有信号，说明姜辣素与DPPH自由基的物质的量比为2.0的条件下对DPPH自由基清除效果较好。

由以上实验可知，自由基的特征吸收磁场强度在3250～3450G之间，随着时间的的延长，EPR谱信号强度降低，峰面积减小，反映了DPPH自由基的清除效果增强。随着姜油树脂中姜辣素与DPPH自由基的物质的量比的增加，其清除平衡的时间就越短，姜辣素清除自由基的效果更佳。当姜辣素与DPPH自由基的物质的量比达到2.0时，5min后就检测不出自由基。

2.2 姜辣素清除DPPH自由基动力学

根据系列图1～8，可见DPPH自由基为五重峰，采用Origin7.0软件计算峰面积，以峰面积大小来评价提取物清除DPPH自由基的能力。采用1.2.2节方法测定DPPH自由基剩余率。以时间为横坐标，DPPH自由基剩余率为纵坐标，得到姜辣素清除DPPH自由基动力学曲线如图9所示。

图9 姜辣素与DPPH自由基不同物质的量比时清除DPPH自由基动力学曲线Fig.9 Scavenging kinetics of DPPH free radicals by gingerol

EC50，定义为使起始DPPH自由基浓度降低50%所需提取物的量，其倒数(1/EC50)为抗自由基能力(ARP)。由定义可以看出，ARP越大，提取物越有效。

取姜辣素与自由基的物质的物质的量比为横坐标，自由基清除平衡时的DPPH自由基剩余率为纵坐标作图得图10，计算EC50。

图10 姜辣素清除DPPH自由基的EC50Fig.10 EC50of gingerol for scavenging DPPH free radicals

由图10可见，姜辣素与DPPH自由基的物质的量比约为0.25时，对应DPPH自由基的EC50，故其ARP为4。一些常见的抗氧化剂的ARP为：抗坏血酸3.7、BHA为4.17、BHT为4.2[11]。

3 讨论

采用顺磁共振法测定姜油树脂对DPPH自由基的清除率，实验结果表明：姜油树脂具有良好的抗DPPH自由基能力，姜油树脂中姜辣素与DPPH自由基的物质的量比为0.25时，可以清除50%的DPPH自由基。姜油树脂能有效清除DPPH自由基，据参考相关文献[12-13]报道，姜油树脂对羟基自由基、超氧自由基也有较好的清除效果。姜油树脂含有的清除自由基的天然活性成分，可以进一步研究开发高效、安全、稳定的抗衰老食品的功效添加剂。

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Using ESR for Measuring DPPH Free Radical Scavenging Activity of Gingerol Oleoresin

GE Qing-feng，SONG Ming-jun，GU Lin*
(School of Food Science and Engineering, Yangzhou University, Yangzhou 225127, China )

TS201.2

1002-6630(2010)15-0121-05