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不同居属地半夏核苷类有效成分的比较研究

2010-09-13戴小斌谈献和王康才

中国医药导报 2010年31期
关键词:尿嘧啶鸟苷居群

戴小斌 ,谈献和 ,吴 皓 ,王康才 , 张 瑜

(1.南京中医药大学药学院,江苏南京 210046;2.南京农业大学,江苏南京 210000)

半夏为天南星科植物半夏Pinellia ternata(Thunb.)Breit.的干燥块茎,是我国传统的大宗药材,其性温味辛,有毒,具有燥湿化痰、降逆止呕、消痞散结之功能[1],是历代医家治疗疾病的要药。半夏块茎的质量是半夏药材品质及质量控制研究的关键,半夏块茎为植物的贮藏器官,含多种药效成分,目前评价半夏质量尚未有统一的成分指标[2],但以鸟苷和总生物碱作为半夏评价指标成分已被广泛应用[3-7]。张科卫等[8]在测定不同居群半夏药材中鸟苷含量时得出,利用超声水提,采用高效液相色谱法(HPLC)测定半夏药材中的核苷含量(以鸟苷计),该法简便、快速、准确、重现性好,可作为半夏药材中核苷含量的检测。本课题采用该法测定半夏核苷类成分含量,比较不同居群之间的差异,为选育半夏优良品种提供依据。本课题测定半夏总核苷类成分时以鸟苷计。

1 仪器与试药

BP211D电子分析天平(德国Sartorious公司),H66025T超声清洗机 (无锡超声电子设备厂),TDL-5离心机(centrifuge公司),数显恒温水浴锅(上海申胜生物技术有限公司),石英亚沸高纯水蒸馏器(江苏金城国胜实验仪器厂),Waters 2690高效液相色谱仪,996PDA二极管矩阵检测器,Millinnium 32色谱工作站,色谱柱 ACE5 AQ(150 mm×4.6 mm,5 μm)。 尿嘧啶、黄嘌呤、尿嘧啶核苷、次黄嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷对照品均购自中国药品生物制品检定所。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

精密称取尿嘧啶、黄嘌呤、尿嘧啶核苷、次黄嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷对照品各 6.07、3.32、8.72、3.28、10.0 mg于 100 ml量瓶中,加蒸馏水定容,即为混合对照品储备液。采用逐级稀释法一次取混合对照品储备液 1、5、10、15、20、25 ml至 100 ml量瓶中,加水至刻度,即以此为 1、2、3、4、5、6 号混合对照品溶液。以鸟苷计,各混合对照品溶液中鸟苷浓度分别为1、5、10、15、20、25 g/ml。

2.2 半夏样品

共收集到11批样品(表1),分别来自四川、山东、山西、江苏、湖北、江西等六省的不同地区的半夏原药材,经我校药植教研室谈献和教授鉴定为天南星科植物三叶半夏Pinellia ternata(Thunb.)Breit.的干燥块茎。将其在60℃烘干,打粉,过4号筛,即得本品粉末,贴上标签,做好记号,备用。

2.3 供试品溶液制备

取本品粉末约1 g,精密称定,置离心管中,加入10 ml蒸馏水,超声处理(功率 500 W,频率 40 kHz)30 min,离心(3 000 r/min),将上层水液倒入蒸发皿中,如此超声、离心重复3次,合并上层水液,置水浴锅上蒸发浓缩,浓缩液转移至10 ml量瓶中,加蒸馏水至刻度,摇匀,即得。每个样品平行制备3份供试品溶液。

2.4 系统适应性试验

色谱条件的选择:以乙腈-水系统为流动相进行色谱分析,流动相为乙腈-水(0.1∶99.9),25 min 后以高浓度有机溶剂洗脱;测定波长:综合五种化合物的紫外光谱,将其测定波长确定在 254 nm;柱温:30℃;流速:0.8 ml/min。

2.5 方法学考察

2.5.1 线性关系考察 取上述各不同鸟苷浓度的混合对照品溶液,每个浓度进样2次,记录鸟苷对应的保留时间处的峰面积。以对照品浓度对平均峰面积值进行回归,得到回归方程为 A=5.730 2×107C-52 961(r=0.999 4),可见鸟苷在 0.928~24.734 g/ml范围内线性关系良好,见图1。

2.5.2 精密度试验 取4号混合对照品溶液连续进样6次,以鸟苷为指标进行精密度考察试验,得出RSD=0.07%,符合要求。

2.5.3 稳定性试验 取上述半夏供试品溶液,隔2 h测1次,共测6次。结果表明,供试液中鸟苷在10 h内稳定,RSD为1.35%,符合要求。

2.5.4 重复性试验 取重庆半夏样品粉末,平行处理6份,依法测定鸟苷含量,得出鸟苷含量RSD为2.40%,重复性良好。

2.5.5 回收率试验 精密称取重庆半夏粉末共6份,各0.5 g,精密称定,置50 ml具塞三角瓶中,分别加入对照品溶液稀释液1 ml,再分别加入水至10 ml,与供试品溶液同法提取检测。计算鸟苷的回收率为102.74%,RSD为2.91%,符合要求。

2.6 不同居群半夏中核苷的含量测定(以鸟苷计)

取上述供试品溶液进样,每份进样1次,进样量20 μl。取峰面积计算鸟苷含量,对照品溶液随行对照。在检测波长254 nm下,得出半夏对照品溶液和供试品溶液(以重庆半夏为例) 的 HPLC图,分别以图 2、3。 图谱中 peak1、peak2、peak3、peak4、peak5分别代表尿嘧啶、黄嘌呤、尿嘧啶核苷、次黄嘌呤核苷、鸟嘌呤核苷的保留值。图3表明重庆半夏中5种核苷类成分均含有,而计算时则以鸟嘌呤核苷计。

2.7 结果

实验原始数据(表1)表明,虽然由于操作失误等原因,个别产地的个别编号未测出某些核苷类成分,但总体看,用于本次实验的各个批次半夏均含有尿嘧啶、黄嘌呤、尿嘧啶核苷、次黄嘌呤核苷、鸟苷等5种核苷类成分。

鸟苷含量计算方法:将各批次各编号半夏供试品溶液得出的鸟苷峰面积A代入标准曲线,即得鸟苷浓度C(mg/ml)。鸟苷含量=C×10/(W×1 000)×100%。不同批次鸟苷含量比较,见表1。

表1 不同批次鸟苷含量比较

由上表得出,不同居群半夏中的核苷类成分含量存在显著性差异,以鸟苷计,江苏泰半夏核苷类成分含量最高,重庆半夏略低,两者均达到了0.05%,而以湖北荆半夏最低,总体为0.016 1%~0.058 4%。

3 讨论

半夏中总生物碱部位具有抗感染活性,其中所含的核苷类成分是抗感染主要活性组分。实验结果客观地反映了不同居属地半夏品质的差异,从药效学角度为半夏的新品种选育研究提供参考,为更好地开发利用半夏资源奠定基础。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].一部.北京∶化学工业出版社,2005∶78.

[2]郭巧生,段金廒,贺善安.半夏不同居群3种化学成分的动态比较研究[J].中国中药杂志,2001,26(5)∶2961.

[3]张科卫,吴皓,崔小兵,等.不同产区半夏药材中鸟苷含量的测定[J].中成药,2000,22(1)∶7691.

[4]于超,张明,王宇,等.栽培、野生及不同产地半夏总生物碱测定[J].中国中药杂志,2004,29(6)∶5831.

[5]白权,李敏,贾敏如,等.川产半夏3种化学成分的比较[J].中国中药杂志,2004,29(7)∶6971.

[6]吴皓,文红梅,郭戎,等.半夏姜制对鸟苷含量的影响[J].中国中药杂志,1998,23(11)∶661.

[7]鹿野美弘,有元良帜子,赵昌代,等.小半夏加茯苓汤ぉけゐ[半夏]の指标物质[J].生药学杂志,1987,41(4)∶282.

[8]张科卫,吴皓,崔小兵,等.不同产区半夏药材中鸟苷含量的测定[J].中成药,2000,22(11)∶769.

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