高血压患者颈动脉粥样硬化与血清中sICAM-1水平及K469E基因多态性的相关性研究

林秋伟，陈富荣，陈海生，李东风

（1.广州中医药大学第一附属医院，广东广州 510405；2.广东省人民医院，广东广州 510108)

动脉粥样硬化是当今世界威胁人类健康的主要疾病之一，颈动脉位置表浅，已被证实可作为反映全身动脉粥样硬化情况的“窗口”。目前研究普遍认为在动脉粥样硬化斑块形成过程中，病变局部的非特异性炎症反应起了重要作用。研究表明，ICAM-1基因多态性与炎症成分参与的多因素疾病的发生发展密切相关，但目前在ICAM-1基因多态性与颈动脉粥样硬化相关性目前尚无定论[1-2]。为此本文旨在探索ICAM-1基因多态性与颈动脉粥样硬化的关系，为颈动脉粥样硬化的发病机制提供理论依据。

1 对象与方法

1.1 对象

201 例高血压患者中，男112例，女89例；平均年龄（59.3±8.7）岁。高血压按照世界卫生组织收缩压≥140 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa），舒张压≥90 mm Hg诊断标准，并除外合并严重感染、肾功能不全、甲状腺疾病、肝脏疾病、糖尿病、冠心病、继发性高血压及结缔组织病、心衰、癌症等患者。

1.2 方法

1.2.1 基因型分析 取静脉全血2 ml，应用高盐沉淀法提取基因组dNA。PCR方法扩增目的片断。引物序列为：5′-GGGGCTGTGGGGAGGATA-3′（正义链） ;5-CCCCGACTGGACGAGAGG-3′（反义链）；ICAM-1的 PCR 扩增反应体系均为 50 μl， 其中含 10×PCR 缓冲液 5 μl，dNTPs 5 μl，引物P1、P2 各 1 μl，模板dNA 5 μl，TaqDNA 聚合酶 1 U。 置热循环仪中94℃预变性5 min；再按下列程序循环35次，即94℃变性 45 s，72℃退火 45 s，72℃延伸 45 s；末次循环后，72℃延伸5 min[3]。

1.2.2 扩增产物的限制性酶切 取PCR扩增产物10 μl，加入由NEB公司生产的BstUⅠ内切酶10 U，置恒温水浴箱中水浴6 h。取PCR酶切产物10 μl在3%琼脂糖凝胶上电泳，EB染色，染色后经紫外灯判断结果并拍照。

1.2.3 血清ICAM-1水平的检测 采用酶联免疫吸附实验测定ICAM-1血清水平，每次测定均严格按说明书操作[4]。

1.2.4 统计学分析 采用SPSS 13.0统计软件。基因型及等位基因频率采用基因计数法计算，计算各等位基因频率分布，吻合度检查确定是否符合Hardy－Weinberg平衡定律；计量资料两均数比较采用t检验，多均数比较采用方差分析；多元逐步回归分析颈总动脉有关指标的影响因素；因素相关性采用Spearman等级相关或Pearson相关分析[5]。

2 结果

2.1 ICAM-1基因型分析

ICAM-1第6外显子A＞G的点突变导致编码的第469氨基酸赖氨酸（K）到谷氨酸（E）的改变。ICAM-1 PCR扩增产物片段大小为223 bp，根据限制性内切酶BstUⅠ酶切片段的情况，基因型有3种，KK型（223 bp 1条带），EK型（223 bp、136 bp、87 bp 3 条带）， EE 型（136 bp、87 bp 2 条带）。 本实验中，对照组和EH组均可见到三种基因型，即KK型，EK型和EE型。经χ2检验，对照组和EH组的基因型分别均符合Hardy-Weinberg 遗传平衡定律， 对照组 （χ2＝0.25，df＝1，P＞0.05），EH 组（χ2＝0.316，df＝1，P＞0.05），表明来自同一人群，说明研究结果具有群体代表性。电泳结果见图1。

2.2 ICAM-1基因各基因型在对照组和EH组中的分布

正常组 KK、KE、EE 基因型频率分别为 0.491、0.434、0.075； 高血压组 KK、KE、EE基因型频率分别为 0.512、0.418、0.070，基因构成无显著性差异（χ2=0.141， P＞0.05）。 正常组K等位基因频率为0.708，E等位基因频率为0.292；高血压组K等位基因频率为0.721，E等位基因频率为0.297，基因频率亦无显著性差异（χ2=0.131，P＞0.05）。

2.3 高血压组不同ICAM-1基因型颈总动脉相关指标比较

高血压组不同ICAM-1基因型颈总动脉内膜-中膜厚度、管腔内径（D）及管腔内径与壁腔比值（I/D）比较，其中KE+EE基因型组颈总动脉IMT、I/D比值显著高于KK基因型组 （P＜0.05和P＜0.01），KK基因型组颈总动脉管腔内径与KE＋EE基因型组无显著性差异（表1）。

表1 高血压组不同ICAM-1基因型颈总动脉相关指标比较（±s）Tab.1 Comparison of index of correlation of thedifferent ICAM-1gene polymorphisms arteria carotis communis in EHgroup(±s)

表1 高血压组不同ICAM-1基因型颈总动脉相关指标比较（±s）Tab.1 Comparison of index of correlation of thedifferent ICAM-1gene polymorphisms arteria carotis communis in EHgroup(±s)

项目 KK基因组 KE＋EE基因组P值例数年龄（岁）吸烟（%）收缩压（mm Hg）舒张压（mm Hg）BMI（cm）TC（mmol/L）TG（mmol/L）LDL（mmol/L）HDL（mmol/L）GLU（mmol/L）IMT（mm）D（mm）I/D 103 58.6±12.6 34.0 165.3±30.1 87.2±20.4 25.64±5.21 5.02±0.96 1.41±0.11 3.05±0.14 1.25±0.72 5.21±0.14 0.89±0.21 8.23±0.95 0.11±0.02 98 59.8±14.5 39.2 161.8±36.2 89.1±22.4 26.98±5.87 4.89±0.88 1.44±0.13 3.01±0.09 1.18±0.81 5.07±0.18 1.13±0.13 8.19±1.11 0.14±0.02＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05＞0.05<0.05＞0.05＜0.01

2.4 颈动脉内膜-中膜厚度（IMT）相关因素分析

高血压组颈总动脉内膜-中膜厚度回归分析：将收缩压、舒张压、TG、TC、LDL-C、HDL、年龄、体重指数、吸烟以及ICAM-1基因型做逐步回归分析结果显示，年龄是颈动脉内膜-中膜厚度的主要影响因素（B=0.197，P＜0.05）；ICAM-1 基因型也是颈总动脉内膜-中膜厚度的一个影响因素（B=0.192，P＜0.05）[7-8]。

3 讨论

心脑血管疾病是危害人类健康的严重疾病，动脉粥样硬化无疑是引起心脑血管疾病的首要原因。颈动脉位置表浅，已被证实可作为反映全身动脉粥样硬化情况的 “窗口”。颈动脉IMT直接反映颈动脉粥样硬化的程度，Salonen等报道颈总动脉的最大中层内膜（IMT）厚度与发生急性心肌梗死的危险度显著相关，所以颈动脉IMT增加是一种早期反映动脉粥样硬化的无创性指标[9]。目前研究普遍认为，动脉粥样硬化的发生发展是一个缓慢而复杂的过程，其发病机制牵涉多种因素，高血压是颈动脉内膜增厚、斑块形成的重要因素[10]，但长期随访发现经降压治疗血压维持正常的高血压患者与正常血压者相比仍有较高的心血管病发生率，说明动脉粥样硬化是复杂的、多因素参与的动态过程。目前研究普遍认为，在动脉粥样硬化斑块形成过程中，病变局部的非特异性炎症反应起了重要作用[11]，而此类炎症反应是通过多种炎症介质产生，ICAM-1是其中一种。尽管ICAM-1在介导白细胞间黏附聚集、白细胞外渗、白细胞与内皮细胞间黏附等过程中的作用已被详细阐明[7]，但是ICAM-1的基因多态性与高血压颈动脉粥样硬化相关机制还不清楚。已有学者对周围动脉闭塞性疾病及多发性硬化患者进行基因分析，发现周围动脉闭塞性疾病患者EE基因型比对照组明显增加[12]。这表明ICAM-1基因多态性与炎症成分参与的多因素疾病的发生发展密切相关。我们对中国广东地区307例汉族人（高血压患者201例，正常对照106例）的研究结果显示，高血压组和对照组的E、K等位基因频率，分别为 0.292、0.708和 0.279、0.721，比较无显著性差异（χ2=0.131，P=0.717 4）。另外笔者对201例高血压患者进行ICAM-1基因K469E多态性进行分析发现，高血压患者EK和EE基因型组平均IMT高于KK基因型组。即KE+EE基因型高血压患者颈总动脉硬化程度比KK纯合子显著，E等位基因携带者可能是高血压病发生动脉硬化的一个易感因素。多元逐步回归分析也提示，E等位基因是原发性高血压患者动脉硬化的影响因素，但其作用可能不如年龄及血压、血脂对动脉硬化作用大，是独于传统的易患因素如高血压、高脂血症等之外的一个因素，确切的机制和影响因素有待于进一步探讨。

同时，笔者也对高血压与血清中可溶性ICAM-1进性了探讨，结果显示在控制其他危险因素及排除高血压严重并发症的干扰后，发现高血压患者sICAM-1浓度与颈动脉病变程度呈正相关，即随着颈动脉病变的加重，sICAM-1浓度增高。说明高血压患者血液中sICAM-1浓度增高与颈动脉损伤、粥样硬化形成密切相关，因而在除外其他炎症反应的情况下，sICAM-1的水平可间接反映颈动脉粥样硬化的程度。

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