HPLC法测定银杏叶软胶囊中总黄酮的含量

叶秀波 ，岑帼英 ，李瑞明

（1.广州市海珠区中医院，广东广州 510220；2.中山大学附属第一医院药学部，广东广州 510080）

银杏叶软胶囊是由银杏提取物与适量的基质制成的软胶囊，银杏提取物中含有黄酮类化合物和银杏总内酯两类生物活性物。其中，总黄酮类包括槲皮素、山奈素、异鼠李素等，共同作用于心脑和外周末梢血管系统，促进血液循环和改善末梢血液的运行，从而预防血管系统循环障碍所引起的各种症状。另外，黄酮类化合物有清除游离氧的抗氧化等药理作用[1]。本文用HPLC法测定总黄酮的含量，为建立银杏叶软胶囊质量控制方法提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-2010高效液相色谱仪 （日本岛津公司）；KQ-300超声清洗仪 （昆山市超声仪器有限公司）；色谱柱Agilent C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）。

1.2 试药

槲皮素对照品（供含量测定用，批号：10081-200406，中国药品生物制品检验所）；山奈素对照品（供含量测定用，批号：110861-200303，中国药品生物制品检验所）；异鼠李素对照品（供含量测定用，批号：110860-200205，中国药品生物制品检验所）；甲醇为色谱纯，水为重蒸馏水，其他试剂均为分析纯，银杏叶软胶囊（批号：080510、080920、091026，广州美丽康有限公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用 Agilent C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱，流动相为甲醇-水（50∶50）（用磷酸调 pH 为 2.5），流速为 1.0 ml/min，检测波长为360 nm[2]，柱温为30℃。在本条件下，槲皮素、山奈素、异鼠李素能达到较好分离，其他成分对测定无干扰，结果见图1。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液的制备 精密称取槲皮素、山奈素、异鼠李素对照品适量加甲醇制成槲皮素浓度为 1.0 mg/ml、山奈素浓度为0.1 mg/ml、异鼠李素浓度为0.1 mg/ml的单一成分对照品贮备液。分别精密量取上述槲皮素对照品贮备液4 ml、山奈素对照品贮备液4 ml、异鼠李素贮备液1 ml，置10 ml量瓶中用甲醇定容至刻度，摇匀，即得槲皮素浓度为0.4384mg/ml、山奈素浓度为0.042 2 mg/ml、异鼠李素浓度为0.010 0 mg/ml的混合对照品溶液[3-6]。

2.2.2 供试品溶液的制备 取本品装量差异下的内容物2 g，精密称定，加20 ml甲醇超声提取30 min，滤过，滤液加入1.5 mol/L盐酸溶液20 ml，水浴回流3 h，冷却后用甲醇定容至50 ml量瓶，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜滤过，即得[3]。

2.3 线性关系的考察

精密吸取“2.2.1”项下槲皮素、山奈素、异鼠李素备用对照品溶液加甲醇配制成含一系列浓度的混合溶液：对照品溶液1（含槲皮素 0.050 mg/ml、山奈素 0.005 mg/ml、异鼠李素0.005 mg/ml），对照品溶液 2（含槲皮素 0.100 mg/ml、山奈素0.010 mg/ml、异鼠李素 0.010 mg/ml），对照品溶液 3（含槲皮素 0.150 mg/ml、山奈素 0.015 mg/ml、异鼠李素 0.015 mg/ml），对照品溶液4（含槲皮素0.300 mg/ml、山奈素0.030 mg/ml、异鼠李素0.030 mg/ml），对照品溶液 5（含槲皮素 0.400 mg/ml、山奈素0.040 mg/ml、异鼠李素0.040 mg/ml）。精密吸取上述对照品溶液各进10 μl记录峰面积，以峰面积Y为纵坐标，进样量X（mg/g）为横坐标进行线性回归，得槲皮素、山奈素、异鼠李素的回归方程分别为：槲皮素Y=31 248 671X-15 558（r=0.999 5）；山奈素 Y=30 421 567X+614 692（r=0.999 9）；异鼠李素Y=24 180 214X-225 760（r=0.999 7）。结果表明槲皮素、山奈素、异鼠李素进样量分别在0.050～0.400、0.005～0.040、0.005～0.040 μg范围内与峰面积呈良好线性关系。

2.4 精密度试验

精密吸取混合对照品溶液10 μl，重复进样5次，记录峰面积。结果槲皮素、山奈素、异鼠李素的峰面积的RSD分别为1.8%、1.7%、1.6%。结果表明本法精密度良好。

2.5 稳定性试验

取银杏叶软胶囊（批号：080510）的供试品溶液，分别于（0、1、2、4、8、12、24 h）进样 20 μl记录峰面积，结果槲皮素、山奈素、异鼠李素的峰面积的RSD分别为2.8%、2.5%、2.8%。结果表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

2.6 重现性试验

取同一批号银杏叶软胶囊 （批号：080510）各6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别进样20 μl，记录峰面积，计算含量，再按总黄酮醇苷含量=（槲皮素含量+山柰素含量+异鼠李素含量）×2.51[2]计算，样品中槲皮素、山奈素、异鼠李素的含量分别为2.33、0.19、0.06 mg/粒，总黄酮醇苷平均含量为6.46 mg/粒（RSD=1.5%）。结果表明本法重复性良好。

2.7 加样回收率试验

精密称取已知含量的同一批号银杏叶软胶囊 （批号：080510）适量，按表1精密加入对照品，按供试品溶液制备项下操作测定，结果见表1。

表1 回收率试验结果（n=9）Tab.1 Results of recovery test(n=9)

2.8 样品含量测定

分别取3批银杏叶软胶囊样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液。分别精密吸取“2.2.1”项下混合对照品溶液10 μl及供试品溶液20 μl，注入色谱仪，记录峰面积。按外标法计算样品中槲皮素、山奈素、异鼠李素的含量，并换算成总黄酮醇苷的含量，结果见表2。

表2 样品含量测定结果（%，n=3）Tab.2 Content determination results of samples(%，n=3)

3 讨论

在提取过程中，比较采用甲醇-25%盐酸溶液（4∶1）的混合溶液水浴加热回流法、甲醇超声提取、盐酸加热水解法三种不同的提取方法，结果表明盐酸水解法效果较好，能将黄酮醇苷类成分水解完全。

为了使所检测的色谱峰分离度好，出峰时间合理，试用甲醇-0.4%磷酸溶液（50∶50）及甲醇-水（50∶50）（用磷酸调pH=2.5），结果选用甲醇-水（50∶50）（用磷酸调 pH=2.5）作为流动相时各个色谱峰的分离效果好。

[1]李冶,郑伟文.银杏叶提取物的药理研究与临床应用[J].现代食品与药品杂志,2007,2(31)∶1452-1454.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].一部.北京∶化学工业出版社,2005∶153.

[3]卫生部.保健食品检验与评价技术规范手册[S].北京∶清华同方电子出版社,2003.

[4]马梅芳,吕文海.HPLC法同时测定南葶苈子饮片中槲皮素、山奈素及异鼠李素的含量[J].中国药事,2009,(1)∶65-67.

[5]杜瑞芳,王雨梅,刘卫东,等.高效液相色谱法同时测定沙枣中槲皮素和异鼠李素的含量[J].时珍国医国药,2008,4(19)∶831-832.

[6]丁立新,李春英,孙启芬.高效液相色谱法同时测定小叶金钱草中槲皮素和山奈素的含量[J].黑龙江医药科学,2009,32(5)∶458.