金顶侧耳多糖提取工艺及其参数优化

张婷婷，马磊，邱凌

（1.西北农林科技大学林学院，陕西杨凌712100；2.西北农林科技大学农业部沼气西北分中心，陕西杨凌712100；3.石河子大学生命科学学院，新疆石河子832003）

金顶侧耳多糖提取工艺及其参数优化

张婷婷1,3，马磊3，邱凌2,*

（1.西北农林科技大学林学院，陕西杨凌712100；2.西北农林科技大学农业部沼气西北分中心，陕西杨凌712100；3.石河子大学生命科学学院，新疆石河子832003）

为提高金顶侧耳多糖提取率、降低提取成本，分别采用单因素试验和正交旋转组合多因素试验，对影响多糖碱提工艺的4个主要因素（温度、时间、液固比和乙醇用量）进行分析，建立数学模型，并确定最优工艺方案。二次回归正交试验结果表明，影响多糖提取率的主次因素顺序依次为温度、液固比、乙醇用量、提取时间。同时，温度与时间、温度与液固比的交互效应均极显著（P<0.0001）。金顶侧耳多糖各因素提取条件的最适范围为乙醇用量为3.4倍～4.0倍，液固比为 38.3∶1～43.0∶1（mL/g），提取时间为 3.4 h～3.9 h 和温度在 95.1 ℃～97.5℃。

金顶侧耳；多糖；模型分析；优化设计

Abstract：Using the single factor experiments and the orthogonal multi-factor experiments,we studied the influence of temperature,time,liquid-solid ratio and alcohol consumption on the polysaccharide extraction in Pleurotus Citrinopileatus.We then use a model to fit the relationship between these four factors and the extracted rate of polysaccharide.In the multi-factor test,temperature was the first greatest factor that influenced the extraction rate of polysaccharides,and liquid-solid ratio was the second one,and alcohol consumption the third one,and the extraction time was the weakest one.The interaction between temperature and time and the interaction between temperature and the liquid-solid ratio were significant（P<0.0001）.When the ethanol dosage within 3.4-4.0 times and the ratio of liquid to solid within 38.3∶1-43.0∶1 （mL/g）,the extraction time within 3.4 h-3.9 h and the temperature within 95.1℃-97.5℃,the polysaccharide extraction rate was the best.

Key words:Pleurotus citrinopileatus;polysaccharide;model analysis;optimize

金顶侧耳（P.citrinopileatus）又名榆黄菇[1]。肉质鲜嫩美味，营养丰富。目前研究表明，金顶侧耳子实体中分离出的多糖能够清除超氧阴离子自由基，从而起到抗衰老的作用，并且具有增强人体免疫力和抗肿瘤、抗辐射、抗疲劳的功效[2]。从多糖的提取物中还可以分离得到降血酯活性成分洛伐他汀[3]。同时金顶侧耳多糖对小鼠的体液免疫系统和细胞免疫功能均有明显的增强作用[4]。

目前虽然食用菌多糖提取工艺研究报道较多，但对金顶侧耳的相关文献较少，并且普遍存在着低提取率，高成本的问题。如何提高多糖提取率是优化工艺手段中的难题，如何使影响多糖提取率的各因素之间相互组合，相互作用，从而达到一种高提取率的平衡，是多糖提取研究领域中的难点[5]。温度、时间、液固比和乙醇用量这些工艺参数的变化，都能够直接影响到多糖提取率。本研究使用碱提金顶侧耳子实体干粉的方法，分别采用单因素试验和正交旋转组合设计试验，对影响多糖提取率的主要因素进行研究，建立提取工艺的数学模型，确定金顶侧耳多糖提取的最佳参数，从而达到低耗能，高提取率的优化目的。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

金顶侧耳、葡萄糖（105℃干燥至恒重）、重蒸酚、氢氧化钠、95%乙醇、浓硫酸均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

多功能粉碎机、SK32004型超声波仪：上海科导仪器公司；XW-80A漩涡混合器：江苏海门市其林贝尔仪器公司；DKZ-2型电热恒温震荡水槽：上海精宏试验设备公司；减压抽滤器、spectrumlab54紫外分光光度计：上海棱光技术有限公司；GL-20G-Ⅱ型高速冷冻离心机：上海安亭仪器公司。

1.3 方法

1.3.1 含糖量标准曲线的测定

采用苯酚-硫酸法测定多糖含量。以葡萄糖含量（mg/mL）为横坐标（x），490 nm波长下吸光值为纵坐标（y），绘制得到标准曲线y=0.152 x-0.007,R2=0.994。

1.3.2 多糖碱提试验

将金顶侧耳子实体在60℃下烘干后，粉碎过50目筛3次，称取金顶侧耳干粉2 g，分别加入不同体积的碱液中（pH=10）用超声波仪处理15 min，使其充分混匀，碱液浸提[6]。样品置于一定温度时间下水浴后，进行减压抽滤，保留滤液，弃滤渣。将滤液定容至100 mL，吸取该滤液2 mL，加入相应倍数体积95%乙醇，混匀，放置4℃冰箱醇沉24 h。20℃下6000 r/min离心10 min，弃上清液，用95%乙醇洗涤沉淀3次，加入重蒸水定容至10 mL，用漩涡混合器使沉淀充分溶解于重蒸水后，吸取该溶液0.5mL，进行含糖量的测定。

1.3.3 单因素试验方案

将提取温度、提取时间、浸提时液固比和醇沉的乙醇用量,分别设置 5 个水平:温度为 60、70、80、90、100 ℃，提取时间为 1.5、2、2.5、3、3.5 h，液固比为 10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1，乙醇用量为碱液浸提后滤液的1、2、3、4、5 倍。在做各单因素试验时，除自身的水平可以变化，其他3个因素均采用固定水平，即温度80℃，提取时间2 h，液固比20∶1，乙醇用量2倍。每组试验重复4次，取其平均值，依据含糖量标准曲线，计算多糖得率。

1.3.4 二次回归正交旋转组合试验

单因素试验结果为多因素试验的设计提供了因素水平取值范围参考，采用四因子二次回归正交旋转组合进行设计多因素试验组合[7]，运用Design-expert统计软件对数据进行分析。试验因子乙醇用量、液固比、时间和温度实际的值分别用大写字母变量X1,X2，X3和X4表示，这4个因素对应的无量纲的规范变量，用小写字母x1、x2、x3和x4表示。以0水平为中心，加减各因素的变化区间得到因素水平编码和各变量的取值见表1，试验方案见表2。

表1 多因素试验组合因素水平编码表Table 1 Factors and code levels of experiments

2 结果与分析

2.1 单因素试验

单因素试验见图1。

2.1.1 温度对多糖提取的影响

从图1-a可见，多糖得率随着温度的升高而升高。当温度为60℃时，多糖得率仅为3.66%，随着温度上升至90℃时，多糖得率达到最高值5.84%。当温度上升至100℃时，多糖得率降低至5.58%，这可能是由于过高的温度导致了大分子的多糖键断裂,而造成多糖的损失。在0.01显著水平上90℃极显著。所以90℃是较为理想的碱提温度。

2.1.2 提取时间对多糖得率的影响

在图1-b中，在碱提时间为1.5 h～2 h时，多糖提取率由5.13%上升至5.68%；而在2 h～3.5 h之内，多糖得率由5.68%上升至5.76%，仅增加了0.08%。但各组浸提时间在0.05显著水平上无显著性。因而综合多糖提取率和耗能耗时等方面，较优碱提时间为2.5h。

2.1.3 液固比对多糖得率的影响

在 0.01 显著水平上 20∶1、30∶1、40∶1、50∶1 与 10∶1相比极显著，而前三者彼此之间无显著性。从节约生产成本的角度考虑，20∶1为较佳液固比值。

2.1.4 醇沉作用对多糖得率的影响

在0.01显著水平上2、3、4、5倍与1倍相比极显著。从图1-d可见,随着乙醇体积的增大多糖得率逐渐升高，但当乙醇体积为5倍时，多糖得率却降低至4.83%，这可能是由于过大体积倍数的乙醇导致了多糖再次溶解[8]。就生产投入成本而言，2倍乙醇用量较为理想。

2.2 二次回归正交旋转组合试验

2.2.1 模型拟合

根据四因子二次回归正交旋转组合设计进行多因素组合试验，见表2。

表2 试验设计及结果Table 2 Design and results of experiments

本研究分别用线性、二次和三次模型拟合了试验组合所得多糖提取率。由这3个模型的方差分析，发现线性模型和二次模型均达到较优的拟合效果（P<0.0001），但是二次模型的F值（90.34）大于线性模型的F值（17.841），即二次模型比线性模型更显著。从模型失拟检验分析发现二次模型（P=0.2279）和三次模型（P=0.219）均不显著，但二次模型P值大于三次模型，即二次模型拟合损失小于三次模型，因此二次模型拟合程度优于三次模型。R2值比较,发现用线性、二次和三次模型的回归贡献率分别为0.697、0.979和0.980，另一方面，二次模型的残差平方和（2.243）小于三次模型残差平方和（15.63），即二次模型的预测值更接近于真实值。因此通过上述3种回归模型的综合指标分析，本研究选用二次模型来拟合本试验。

2.2.2 回归方程的建立与检验

通过二次回归模型的方差分析，发现乙醇用量、液固比、提取时间和温度4个因素的一次项和二次项均达到极显著（P<0.0001）,并且只有液固比和温度的交互作用、时间与温度的交互作用达到极显著（P<0.0001）。由于设计具有正交性，各回归系数之间无相关性，因此可直接剔除模型中的不显著项建立回归方程[7,9]。通过整理无量纲方程（1）得到实际值方程（2）：

2.2.3 主效应分析

由于采用正交设计，并且方程（1）各因素均经无量纲线性编码处理，所有回归系数间都是不相关的，因此可以由回归系数绝对值的大小来直接比较各因素的一次项对多糖提取率的影响，各因素影响程度从大到小的排序为温度>液固比>乙醇用量>时间（0.93>0.44>0.43>0.3）。

2.2.4 因素间的交互效应

因素间的交互效应见图2、图3。

在提取多糖过程中，各因素之间并不是简单的独立存在形式，它们之间有共存性且相互影响。温度与时间交互效应达到极显著（P<0.0001），同时从图2中，等高线呈椭圆型，直观体现出二者交互效应显著[10]。通过观察等高线图中发现，当乙醇用量固定为3倍，液固比固定为30∶1的条件下，当温度为85℃，提取时间为2.6 h，多糖提取率达到5.292%。当温度上升至90℃，提取时间降至2.2 h，多糖提取率同样能够达到5.292%。低温长时和高温短时效果相近，所以适当的提高温度，并且适当缩短提取时间，有利于提高多糖提取效率。

温度与液固比交互效应也达到极显著（P<0.0001），从图3中亦能直观的体现出二者显著的交互效应。在提取时间固定为2.5 h，乙醇用量固定为3倍的条件下，当液固比为30∶1，温度为84.7℃时，多糖提取率达到5.229%（图3）。观察发现适当升高温度缩小液固比，或者适当降低温度扩大液固比，均能达到同等水平的多糖提取率。温度与时间交互作用的F值（72.902）高于温度与液固比的F值（36.488），因此温度与时间的交互效应最显著。

由于温度同时和时间，液固比存在着交互效应，因此，高温、短时、低液固比的组合，或者低温、长时、高液固比的组合，都能够达到同等水平的多糖提取率。从生产实际出发，应该因地制宜，选用低成本高效率的工艺提取方案。

2.2.5 确定各因素水平的最优范围

用统计优选方法[7]，每个因素取 5 个水平：±2，±1，0。按照得到的二次模型进行计算机编程，模拟实现625个全因子试验方案，并进行寻优。

统计优选方法预测的提取率高于5.8%的方案共46个（表3），占全部方案的7.4%，进行频数分布分析，发现乙醇用量为 3.4 倍～4.0 倍，液固比为 38.3∶1～43.0∶1（mL/g），提取时间为3.4h～3.9h和温度在95.1℃～97.5℃时，多糖提取率有95%的可能性高于5.8%。

表3 统计优选方法预测提取率大于5.8%的频数分布Table 3 Frequency distribution of the extraction rate greater than 5.8%

3 结论

1）通过二次回归正交旋转组合建立回归的方程，排列出了四因素之间主次关系的顺序，依次为温度>液固比>乙醇用量>时间。

2）在试验范围内，温度和时间的交互效应以及温度和液固比的交互效应均达到极显著（P<0.0001）。因此，高温、短时、低液固比的组合，或者低温、长时、高液固比的组合，都能够达到同等水平的多糖提取率。

3）金顶侧耳多糖得率的最优条件适用范围为乙醇用量为 3.4 倍～4.0 倍，液固比为 38.3∶1～43.0∶1（mL/g），提取时间为3.4 h～3.9 h和温度在95.1℃～97.5℃。

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Parameter Analysis and Optimization of Conditions for Polysaccharides Extracted from Pleurotus Citrinopileatus

ZHANG Ting-ting1,3，MA Lei3，QIU Ling2,*
（1.College of Forestry Northwest A＆F University，Yangling 712100，Shaanxi,China；2.The Northwest Station of Biogas Products and Equipment Quality Test Center of the Ministry of Agriculture，Northwest A＆F University，Yangling 712100，Shaanxi,China；3.College of Life Science，Shihezi University，Shihezi 832003，Xinjiang,China）

2010-04-13

国家科技支撑计划项目（2007BAK31B01）

张婷婷（1984—）,女（汉），助教，在读硕士,主要从事生物能源与环境工程的研究。

*通信作者