耐盐酵母固定化方法的初步研究＊

杨秋明,郭彩华,蔡慧农,王璋

1(集美大学生物工程学院,福建厦门,361021) 2(中国食品发酵工业研究院,北京,100027)

耐盐酵母固定化方法的初步研究＊

杨秋明1,郭彩华1,蔡慧农1,王璋2

1(集美大学生物工程学院,福建厦门,361021) 2(中国食品发酵工业研究院,北京,100027)

以不同的固定化材料对耐盐酵母进行固定化,从中选择适宜的固定化载体。采用正交实验确定了适宜固定化的条件,并采用SPSS统计软件进行极差和方差分析。结果表明,海藻酸钠-氯化钙固定化耐盐酵母优于琼脂、明胶固定化耐盐酵母,当海藻酸钠浓度4 g/100 mL,CaCl2浓度为1.4 mol/L,发酵温度为28℃时,耐盐酵母的固定化效果较好。

耐盐酵母,固定化,载体,真正发酵力

固定化技术是现代生物工程领域的重要内容之一,它是指利用化学或物理手段将游离的细胞(微生物)或酶,定位于限定的空间区域并使其保持活力并可反复使用的一种基本技术[1]。

由于固定化酵母克服了传统游离酵母发酵工艺中酵母与产品分离困难、易流失、影响产品质量等问题,且具有生长快、反应迅速、抗污染能力强、可连续使用、产物分离方便等优点,然而到目前为止,尚无一种可用于所有种类的微生物细胞固定化的通用方法,因此,对某一特定的微生物细胞来说,必须选择其合适的固定化方法和条件[1]。

日本于1982年开始研究把固定化细胞发酵用于酱油酿造,以低盐发酵液为底物,用海藻酸钠、聚乙稀醇或陶瓷制品为载体,分别固定耐盐酵母菌和乳酸菌,以提高酱醪中成味物质的含量,国内也有类似的研究[2]。本论文主要利用包埋法和共价结合法,研究三种载体固定化耐盐酵母的固定化效果,从中选择一种适宜的固定化载体,通过这种固定化载体研究分析载体浓度、固定化温度对固定化耐盐酵母发酵性能的影响,分析固定化酵母与游离酵母发酵性能的区别,优化出耐盐酵母细胞的固定化条件,为酵母细胞的固定化提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验菌株

耐盐酵母拉顶菌名JM01(厦门淘化大同调味品公司提供的后熟酱醪中分离得到的酵母)。

1.1.2 培养基

麦氏培养基(McCLary)(g/L):葡萄糖10.0,KCl 1.8,酵母膏2.5,醋酸钠8.2,NaCl 100.0,琼脂粉15.0,pH自然。

YPD液体培养基(g/L):葡萄糖20.0,酵母粉10.0,蛋白胨20.0,食盐160.0 pH自然。

高糖YPD培养基:在原有YPD培养基的基础上添加5%葡萄糖,5%的蔗糖。

以上培养基灭菌条件均为121℃,20 min。

1.1.3 试剂

酵母粉购买于OXOLD公司,蛋白胨、葡萄糖购买于国药集团化学试剂有限公司,牛肉膏购买于广东环凯微生物科技有限公司;纯化琼脂粉购买于上海中科昆虫生物技术开发有限公司(分装);海藻酸钠购买于青岛洋峰海藻有限公司;食盐、蔗糖食品级;其它试剂均为国产分析纯试剂。

1.1.4 仪器

S W-CJ-2FD型双人单面净化工作台(苏州净化设备有限公司),YXQ-LS-30SⅡ立式压力蒸汽灭菌器(上海博迅实业有限公司医疗设备厂),恒温培养摇床(上海智城分析仪器制造有限公司),生化培养箱(宁波莱福科技有限公司),DBMB5-223JP2-5型数码显微镜(Motic显微镜),721型分光光度计(上海第三分析仪器厂)。一次性注射器:医用级,市售。

1.2 实验方法

1.2.1 耐盐酵母种子培养液的制备

挑取新鲜斜面菌种1环,接入装有30 mL YPD培养基的300 mL锥形瓶中,28℃振荡培养至对数期。取湿菌体细胞,用生理盐水配成10 g/100 mL菌悬液(以湿菌体计)。

1.2.2 耐盐酵母细胞的包埋固定化

(1)琼脂凝胶固定化细胞的制备:4.0 g/100 mL琼脂溶液灭菌后冷却至45℃,以4∶1的比例加入菌悬液,混合均匀,倒入无菌平皿中待凝,待充分凝固后将其切成大小为3×3×3 mm3的块状,用无菌水洗涤。按10%(v/v)接种量将固定化耐盐酵母细胞置于200 mL YPD培养基中,在28℃下发酵 5d。在发酵结束时测定固定化颗粒的强度、耗糖量及透光率。同时,以相同接种量的游离细胞的发酵情况作为对照相比较。

(2)海藻酸钠凝胶固定化细胞的制备:4.0 g/100 mL海藻酸钠溶液灭菌后冷却至45℃,以4∶1的比例加入菌悬液,混合均匀,倒入一次性注射器外套,通过直径为2.5-3.0 mm的小孔,以恒定的速度滴到盛有10%CaCl2溶液(已灭菌)的平皿中制成凝胶珠。浸泡30 min后,将凝胶珠转入300 mL锥形瓶中,用无菌去离子水洗涤。按10%(v/v)接种量将固定化耐盐酵母细胞置于200 mL YPD培养基中,在28℃下发酵5 d。在发酵结束时测定固定化颗粒的强度、耗糖量及透光率。同时,以相同接种量的游离细胞的发酵情况作为对照相比较。

(3)吸取10 mL 10%菌悬液加入25 mL浓度为2 g/100 mL的明胶液中,混合均匀,倒入无菌平皿中,在0-5℃冻结后,切成3×3×3 mm3小块,再浸入1.5%戊二醛中,室温下交联3 h,将颗粒转入300 mL锥形瓶中,用无菌去离子水洗涤3次,按10%(v/v)接种量将固定化耐盐酵母细胞置于200 mL YPD培养基中,在28℃下发酵5 d。在发酵结束时测定固定化颗粒的强度、耗糖量及透光率。同时,以相同接种量的游离细胞的发酵情况作为对照相比较。

1.2.3 耐盐酵母固定化条件的选择

以氯化钙浓度、海藻酸钠浓度和发酵温度为试验因素,采用L9(34)正交实验设计,各因素的水平见表1。

表1 L9(34)正交实验设计因素水平表

用无菌水洗涤凝胶珠后,按10%(v/v)接种量将固定化耐盐酵母细胞置于200 mL高糖YPD培养基中发酵8 d。在发酵结束时测定真正发酵力(耗糖量)。用SPSS大型统计软件进行极差和方差分析[3]。

1.2.4 固定化酵母与游离酵母发酵性能的比较

(1)固定化酵母的发酵试验:将海藻酸钠固定化后的耐盐酵母凝胶珠按10%(v/v)接种量置于200 mL高糖YPD培养基中,在28℃下静止培养。

发酵至规定时间后,滤出固定化耐盐酵母,测定耗糖量。将发酵液倒入蒸馏瓶中蒸馏,截取100 mL蒸馏液,用酒精计测量乙醇体积分数和温度,并校正为20℃下的乙醇体积分数。

(2)游离酵母的发酵试验:将耐盐酵母菌悬液10%(v/v)接种量直接添加于200 mL高糖YPD培养基中,在28℃下静止培养后测定耗糖量及酒精度。

1.2.5 分析测定项目及方法

(1)固定化耐盐酵母机械强度的测定[4]:取30个固定化耐盐酵母颗粒,测定使其变形一半时所需的压力。

(2)乙醇生成量的测定:蒸馏后用酒精计测量[5]。

(3)糖含量的测定:用斐林试剂法测定发酵液的糖度[6]。

真正发酵力=(发酵液初始糖度-发酵结束后发酵液残糖度)/发酵液初始糖度

(4)细胞固定效果测定:于波长650 nm下,用721型分光光度计测定发酵液的透光率确定。

2 结果与分析

2.1 固定化载体的选择

固定化颗粒的强度是影响其应用的重要因素。从固定化强度来分析,海藻酸钙固定化的效果优于琼脂和明胶的固定化,见表2。比较海藻酸钙固定法和琼脂固定法,由于海藻酸钙中大量的阳离子Ca2+与酵母细胞壁及膜上的阴离子集团结合紧密,使细胞不易逸出。而琼脂为非极性大分子多糖,其凝胶环境不利于和酵母菌结合,使得相当一部分细胞逸出凝胶,因而海藻酸钙固定化优于琼脂固定化的效果。

使用固定化耐盐酵母时,酵母细胞应牢固地包埋在凝胶中,避免细胞游离逸出,使发酵液保持澄清,容易分离。在发酵液中,游离的细胞愈多,则发酵液的透光率越低。从透光率分析是海藻酸钙的包埋效果最好,琼脂其次,明胶的包埋效果最差。从真正发酵力来看海藻酸钙固定化的发酵力比琼脂和明胶固定化的要小,说明细胞游离逸出较慢。综合考虑,选择海藻酸钙作为固定耐盐酵母的载体。

表2 不同固定化方法的固定效果比较

2.2 耐盐酵母细胞固定化条件分析

海藻酸钠是从海藻提取获取的藻酸盐,为 D-甘露糖醛酸和古洛糖醛酸的线性共聚物,多价阳离子(如 Ca2+)可诱导凝胶。Ca2+是决定海藻酸钙固定化酵母机械强度的重要因素,随着 Ca2+浓度的增加,固定化酵母的强度增加,适宜的海藻酸钠的浓度使凝胶相对渗透性能好,有利于底物的进入和产物排出,因此,利于耐盐酵母细胞的发酵作用。

从极差分析结果可以看出,三个试验因素对固定化耐盐酵母真正发酵力的影响主次顺序为海藻酸钠浓度 B>氯化钙浓度 A>发酵温度 C,即海藻酸钠浓度对固定化酵母的发酵性能影响最大,其次是氯化钙浓度,发酵温度影响最小。

表3 固定化条件的优化试验结果极差分析

表4 固定化条件的优化试验结果方差分析

表5 方差分析表

通过极差和方差分析可以看出影响固定化耐盐酵母发酵力的因素——海藻酸钠浓度 B 、氯化钙浓度A、发酵温度C,其最优的组合为 A2B2C2或A2B2C1,即氯化钙浓度为1.4 mol/L,海藻酸钠浓度为4 g/100 mL,发酵温度为30℃或28℃时,耐盐酵母的固定化效果最为理想。从实际操作和经济角度综合考虑,发酵温度选取28℃为好。

2.3 固定化耐盐酵母与游离耐盐酵母发酵性能的比较

固定化耐盐酵母和游离耐盐酵母在28℃下发酵21 d的耗糖变化见图1,发酵终了时,相应的乙醇生成量及残糖量见表6。

图1 固定化耐盐酵母与游离耐盐酵母发酵特性曲线

表6 固定化耐盐酵母与游离耐盐酵母产乙醇能力及残糖量的比较

耐盐酵母有延迟发酵的特性,对蔗糖的利用较迟缓,所以试验中以葡萄糖为主要碳源。游离耐盐酵母发酵时,需要有较长的适应期和增殖期,因此,其发酵速度较慢,如图1所示,发酵终结时,残糖量为4.25 g/100 mL,而乙醇量为5.6%(v/v),在正常发酵过程中,由于产物的积累,底物的消耗,大大的改变了生长环境,因此,余下的4.25%(w/v)的糖很难发酵。而固定化的耐盐酵母,由于其酵母集中,又相对处于比较低盐的环境,因而适应期就大大缩短,发酵速度有明显的提高多,发酵终结时,残糖量为3.36 g/100 mL。特别是在发酵前期,即发酵前5 d,这主要是因为此时细胞活性高,底物供应充足,产物浓度很低。因此,发酵速度较快。

3 结论

比较海藻酸钙、琼脂、明胶固定化效果,对耐盐酵母来说,海藻酸钙的固定化效果最为理想。水平正交试验表明影响固定化耐盐酵母真正发酵力因素的主次顺序为海藻酸钠浓度B>氯化钙浓度A>发酵温度C,其优化的条件为氯化钙浓度1.4 mol/L,海藻酸钠浓度4%(w/v),发酵温度为28℃时。固定化耐盐酵母的发酵速度较游离耐盐酵母快,产醇效率固定化耐盐酵母较游离耐盐酵母高0.5%。

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ABSTRACTIn order to get the best carrier,we used different materials to immobilize the salt-tolerant yeast.The optimalimmobilization parameterswere studied by orthogonal experiments,and range analysis and variance analysis were done by using SPSS.The final result showed the sodium alginate and calcium chloride were better than agar and gelatin in immobilization of the salt-resistance yeast.The optimum conditionswere the concentration of sodium alginate4g/100 mL,calcium chloride 1.4 mol/L,at 28℃.Under this condition,the effect of immobilization was better.

Key wordssalt-resistance yeast,immobilization,carrier,real fermenting ability

Prel im inary Research on the I mmobilization of Salt-tolerantYeast

Yang Qiu-ming1,Guo Cai-hua1,Cai Hui-nong1,Wang Zhang2
1(College of Biotechnology,JimeiUniversity,Xiamen 361021,China)
2(China National Institute of Food and Fermentation Industries,Beijing 100027,China)

实验师(蔡慧农教授为通讯作者)。

＊厦门市科技项目资助

2009-12-16,改回日期:2010-02-01