植物乳杆菌ST-Ⅲ菌株降胆固醇影响因素的研究

2010-09-12王荫榆吴正钧刘振民

食品工业科技 2010年8期

关键词：胆盐胆酸乳酸菌

陈帅，刘娟，王荫榆，吴正钧，刘振民

(上海光明乳业技术中心，上海200072)

植物乳杆菌ST-Ⅲ菌株降胆固醇影响因素的研究

陈帅，刘娟，王荫榆，吴正钧，刘振民

(上海光明乳业技术中心，上海200072)

研究发现植物乳杆菌ST－Ⅲ菌株降低胆固醇作用受胆盐和胆固醇影响。在培养基中添加不同的胆盐，能增加ST－Ⅲ菌株降胆固醇能力，依次为牛磺胆酸钠＞牛胆盐＞胆酸，当牛胆盐的添加浓度为3.0g/L时，降胆固醇率达到最高值38.57%;在培养基中添加不同来源和不同浓度的胆固醇，ST－Ⅲ菌株均具有降低作用，但降低能力有差异，依次为羊血清＞鸡蛋黄＞卵磷脂－胆固醇胶束溶液，且降低能力受胆固醇的浓度影响较大，当浓度低于0.5mg/mL时，降胆固醇率可维持在40%左右，高于0.5mg/mL时，降胆固醇效果则显著降低;降胆固醇量在胆固醇浓度为1.0mg/mL时达到最高值307μg/mL，这可能是高浓度胆固醇抑制ST－Ⅲ菌株的生长所致。

植物乳杆菌ST－Ⅲ，降胆固醇，影响因素

Abstract:The influence of cholesterol and bile salts on cholesterol removal ability were tested.The cholesterol removal ability could be increased by adding bile salts into the media，the ability was in order of sodium taurocholic acid ＞ ox bile salt＞ cholic acid.When the concentration of ox bile salt was 3.0g/L，the cholesterol degradation rate reached the highest value 38.57%.ST－Ⅲ could remove cholesterol in different resources of cholesterol，the ability was in the order of sheep serum ＞egg yolk＞ cholesterol－phosphatidylcholine micelles.Cholesterol concentration had influence on its removal by ST－Ⅲ，when the concentration was less than 0.5mg/mL in the medium，the degradation rate maintained around 40%.When higher than 0.5mg/mL，the degradation became decreased with the concentration increased.And the removing content reached the highest value 307μg/mL at the concentration 1.0mg/mL.

Key words:Lactobacillus plantarum ST－Ⅲ;cholesterol removal;influence factors

心血管疾病患病率和死亡率的逐年上升成为引起人类死亡的主要杀手。血清中的胆固醇被认为是诱发冠心病、动脉粥样硬化等心血管疾病的重要危险因素。因此，降低血清中胆固醇的水平直接关系到人类的健康。国内外均有大量研究发现乳酸菌在体内外具有降低胆固醇的益生功能，植物乳杆菌ST－Ⅲ是一株经体内外实验证实具有降胆固醇作用的菌株。本文通过将植物乳杆菌 ST－Ⅲ接种于MRS－THIO液体高胆固醇培养基，研究其在不同培养条件下对胆固醇的降低情况，了解植物乳杆菌ST－Ⅲ菌株降胆固醇特性，为进一步研究植物乳杆菌ST－Ⅲ的降胆固醇机理做好前期准备。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

植物乳杆菌ST－Ⅲ 光明乳业技术中心实验室保藏;MRS液体培养基、MRS－THIO液体培养基在MRS－broth中加入0.2%巯基乙酸钠(THIO);MRSTHIO液体高胆固醇培养基在MRS－THIO液体培养基中添加一定量的胆固醇源;牛磺胆酸钠、水溶性胆固醇 Sigma公司;邻苯二甲醛上海医药上海化学试剂公司;巯基乙酸钠国药集团化学试剂有限公司;三氯甲烷上海试剂一厂。

pH酸度计奥立龙公司;高速冷冻离心机BECKMAN COULTER公司;厌氧培养箱 RUSKINN公司。

1.2 实验方法

1.2.1 胆固醇源的制备方法无菌鸡蛋黄液的制备:市售新鲜草鸡蛋数枚，无菌操作下在鸡蛋一端开口，自然流出蛋清，打开鸡蛋得到无菌蛋黄，无菌吸取蛋黄液到无菌罗口瓶，4℃保存作为胆固醇源待用。无菌羊血清的制备:羊血清经0.22μm膜过滤，4℃保存作为胆固醇源待用。卵磷脂－胆固醇胶束溶液的制备:参照文献［1］。4℃保存，当天使用，0.22μm膜过滤后作为胆固醇源待用。

1.2.2 胆固醇浓度的测定参照文献［2］，制得胆固醇标准曲线。采用邻苯二甲醛法测定胆固醇含量［3］，根据胆固醇标准曲线计算出胆固醇的含量。

1.2.3 样品处理及降胆固醇率的计算将待测培养液进行高速冷冻离心(12000r/min，10min，4℃)，得到的上清液直接用于测定胆固醇，胆固醇降低率的计算公式［4］为:

其中:A为各实验菌株发酵上清液的A550;C为空白对照的A550;D为胆固醇降低率。

1.2.4 胆盐对植物乳杆菌ST－Ⅲ降胆固醇作用的影响

1.2.4.1 植物乳杆菌ST－Ⅲ菌株对不同胆盐的耐受力实验分别采用牛胆盐、胆酸和牛磺胆酸钠作为不同胆盐来检测植物乳杆菌ST－Ⅲ的胆盐耐受力。测定方法参照 Gilliland and Walker［2］，在 MRS－THIO培养基中分别添加0.3%(w/v)的胆盐，空白对照组为MRS－THIO培养基，1%量接入植物乳杆菌ST－Ⅲ菌株后37℃培养。每隔1h测定培养液在620nm处的吸光值及pH，以A620到达0.3的时间差作为菌株胆汁耐受力的评判依据。

1.2.4.2 不同胆盐对植物乳杆菌ST－Ⅲ菌株降胆固醇作用的影响参考Liong M.T.的方法［5］，将植物乳杆菌ST－Ⅲ菌株接种于分别添加0.3%牛胆盐、胆酸和牛磺胆酸钠的MRS－THIO液体高胆固醇培养基(培养基中胆固醇浓度约300μg/mL)，37℃培养24h后进行胆固醇含量测定并计算降低率。

1.2.4.3 胆盐浓度对植物乳杆菌ST－Ⅲ菌株降胆固醇作用的影响将植物乳杆菌ST－Ⅲ菌株接种于不同牛胆盐浓度的MRS－THIO液体高胆固醇培养基，培养基中牛胆盐的终浓度分别为 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0g/L［6］，37℃培养 24h 后测定胆固醇含量并计算降低率。

1.2.5 胆固醇对植物乳杆菌ST－Ⅲ降胆固醇作用的影响

1.2.5.1 胆固醇源对植物乳杆菌ST－Ⅲ菌株降胆固醇作用的影响将植物乳杆菌ST－Ⅲ菌株接种于含有0.3%牛胆盐的MRS－THIO液体培养基，在培养基中分别加入羊血清、鸡蛋黄以及胆固醇胶束溶液作为胆固醇源，37℃培养24h后测定胆固醇含量并计算降低率。

1.2.5.2 胆固醇浓度对植物乳杆菌ST－Ⅲ菌株降胆固醇作用的影响将植物乳杆菌ST－Ⅲ菌株接种于含有0.3%牛胆盐的MRS－THIO液体高胆固醇培养基，胆固醇胶束溶液调节培养基中胆固醇含量，使之分别为 0.5、1.0、1.5、2.0mg/mL［7］，37℃ 培养 24h 后测定胆固醇含量并计算降低率。

2 结果与讨论

2.1 胆固醇标准曲线

以胆固醇浓度对 A550作图，得到胆固醇标准曲线。

图1 胆固醇浓度的标准曲线

2.2 植物乳杆菌ST－Ⅲ菌株对不同胆盐的耐受力

表1为在MRS－THIO培养基中添加牛胆盐、胆酸和牛磺胆酸钠时植物乳杆菌ST－Ⅲ的生长情况，以不添加任何胆盐的MRS－THIO培养基作为空白对照。其中胆酸为游离胆酸，牛磺胆酸钠为结合型胆盐，牛胆盐则为游离胆酸与结合型胆盐的混合物。从表1中可以看出，在含不同胆盐的培养基中ST－Ⅲ菌株所表现出的耐胆盐能力不同，对牛磺胆酸钠的耐受力最强，与对照组相比迟滞时间仅为0.31h;对牛胆盐与胆酸的耐受力较弱，迟滞时间分别为3.75h与3.42h。虽然含胆酸的培养基初始pH最低，但这不是导致ST－Ⅲ菌株生长缓慢的主要原因，Liong［5］也在其实验中发现不同的初始pH对于菌体生长以及耐胆盐能力的影响非常小。由此，可以得知植物乳杆菌ST－Ⅲ对结合型胆盐的耐受能力较强，而对游离胆酸以及混合型胆盐的耐受能力较弱。

表1 植物乳杆菌ST－Ⅲ对不同胆盐的耐受能力

2.3 不同胆盐对降胆固醇作用的影响

Klaver［8］等研究者提出，细菌从培养基中去除胆固醇是游离胆酸和胆固醇在pH低于5.5时共同沉淀的结果，乳酸菌通过水解结合型胆盐转变为游离胆酸，因后者的溶解度降低与胆固醇发生共同沉淀作用，因此，培养基中的胆盐存在与否，胆盐的结合状态都会影响乳酸菌的降胆固醇作用。实验选用三种不同类型的胆盐来研究胆盐对植物乳杆菌ST－Ⅲ降胆固醇作用的影响。

从图2中可以看出，植物乳杆菌ST－Ⅲ菌株在含不同胆盐培养基中的降胆固醇能力虽有所不同，但差别不大。其中对结合型胆盐－牛磺胆酸钠培养基的降胆固醇作用最强，降解率可达44.0%;其次为混合型胆盐培养基，降解率为39.7%;游离胆酸－胆酸培养基降胆固醇作用较弱，但也达到了32.6%。结合植物乳杆菌ST－Ⅲ菌株对不同胆盐的耐受力进行比较，在生长状态最好的牛磺胆酸钠培养基中降胆固醇能力最强，而在生长较弱的胆酸和牛胆汁中降胆固醇能力较弱。这表明植物乳杆菌ST－Ⅲ菌株的降胆固醇作用与菌体生长存在着一定的相关性;但不同胆盐对植物乳杆菌ST－Ⅲ菌株的降胆固醇作用影响不大，因此我们推测植物乳杆菌ST－Ⅲ的降胆固醇作用以同化作用为主，但这还需要进一步的实验来证实。

图2 ST－Ⅲ在不同胆盐培养基中的降胆固醇能力

2.4 胆盐浓度对降胆固醇作用的影响

从图3中可以看出，当培养基中不含胆盐时，植物乳杆菌ST－Ⅲ菌株具有一定的降胆固醇作用，但效果不明显;当培养基加入胆盐后，降胆固醇作用呈现先升高后降低的趋势，当培养基中胆盐浓度为3.0g/L时，降胆固醇作用最强，降胆固醇率可达38.57%，此后随着培养基中胆盐浓度的增高降胆固醇作用开始降低，这有可能是由于胆盐浓度过高抑制了菌体生长所致。但这一现象并不能说明植物乳杆菌ST－Ⅲ菌株的降胆固醇方式以沉淀作用为主，有研究人员发现，在其培养的14株乳杆菌中，在不添加胆盐培养时，上清液胆固醇浓度几乎没有变化，在没有胆盐存在的条件下同化作用和共沉淀作用均未发生。提出胆盐的存在不仅能促使胆固醇共沉淀作用的发生，还能增加细胞膜通透性，利于胆固醇的同化作用［9］。由此我们推测对于植物乳杆菌ST－Ⅲ，随着胆盐浓度的增高不仅沉淀作用增强，同化作用也得到提高。这在后期实验中也得到了证实，在含有0.3%牛胆盐的MRS－THIO高胆固醇培养基中培养24h后，植物乳杆菌ST－Ⅲ菌株的同化作用降胆固醇率达到25.5%，明显高于不添加胆盐培养的降胆固醇率7.79%，同化作用增强。

2.5 胆固醇源对降胆固醇作用的影响

降胆固醇乳酸菌在筛选过程中，胆固醇源的不同导致菌体的降胆固醇能力有所差别。文献中所涉

及到的胆固醇源有血清［10－11］、鸡蛋黄［12－13］、卵磷脂－胆固醇胶束溶液［1，6，14］、胆固醇乙醇溶液［15］等，还有研究直接利用胆固醇含量高的食品基质(奶油)来作为培养基筛选目的菌种［16－17］。由于胆固醇在水中的溶解性极差，一般的方法无法使其在培养基中均匀分布，而血清与鸡蛋黄属于天然高胆固醇产物，其富含的其他物质可帮助胆固醇均匀分布于培养基中，是培养基中胆固醇的较适合来源。因此本实验选用血清、蛋黄和卵磷脂－胆固醇胶束溶液作为不同的胆固醇源测定植物乳杆菌ST－Ⅲ的降胆固醇能力。

图3 胆盐浓度对植物乳杆菌ST－Ⅲ降胆固醇作用的影响

从图4中可以看出，在胆固醇初始浓度相同的条件下，植物乳杆菌ST－Ⅲ菌株在不同胆固醇源中的降胆固醇能力有所差别，降胆固醇能力依次为羊血清＞鸡蛋黄＞卵磷脂－胆固醇胶束溶液，这可能是由于血清和蛋黄中含有的其他物质引起的。从图中还可以看出随着溶液中胆固醇初始浓度的增大，植物乳杆菌ST－Ⅲ菌株的降胆固醇含量也随之升高，胆固醇的降低率基本恒定，这说明植物乳杆菌ST－Ⅲ菌株具有较稳定的降低胆固醇能力。

图4 ST－Ⅲ在不同胆固醇源中的降胆固醇能力

2.6 胆固醇对ST－Ⅲ菌株生长曲线的影响

图5所显示的是植物乳杆菌ST－Ⅲ在添加与不添加胆固醇胶束溶液两种状态下的生长曲线以及培养24h过程中降低胆固醇率的变化。随着培养时间的延长，降胆固醇率呈现不断上升的趋势。从图中可以看出，在培养4h后，添加胆固醇培养的植物乳杆菌ST－Ⅲ菌株较未添加相比生长较快，在达到稳定期时，A620处的吸光值已明显高于不含有胆固醇培养基的植物乳杆菌ST－Ⅲ菌株，这说明胆固醇对植物乳杆菌ST－Ⅲ菌株的生长具有促进作用。从图中还可以看出，植物乳杆菌ST－Ⅲ菌株的降胆固醇作用与菌体生长存在着一定的相关性，当植物乳杆菌ST－Ⅲ菌株进入对数生长期，降胆固醇作用明显增强，我们推测植物乳杆菌ST－Ⅲ菌株的降胆固醇作用极有可能是菌株代谢产物的作用结果。

2.7 胆固醇浓度对降胆固醇作用的影响

胆固醇浓度对降胆固醇作用影响的实验结果见图6，胆固醇初始浓度不同，植物乳杆菌ST－Ⅲ所表现出的降胆固醇率以及降胆固醇含量也有所差异。从图中可以看出，当胆固醇初始浓度较低时，植物乳杆菌ST－Ⅲ菌株的降胆固醇率维持在一个恒定的范围内，在40%左右;当浓度大于0.5mg/mL时，降胆固醇率开始呈下降趋势;而降胆固醇量一开始则随着胆固醇浓度的增大而增大，当浓度达到1.0mg/mL时降低量达到最大值307μg/mL，此后则不再随着浓度的升高而增大，开始呈降低趋势，这可能是胆固醇浓度过高抑制了菌体的生长代谢所引起的。虽然降胆固醇含量在浓度为1.0mg/mL时达到最大值，但从此处的降胆固醇率可以看出，菌体生长已经受到一定的抑制作用而使降胆固醇率有所下降，但由于培养基中胆固醇初始浓度高，以致于降胆固醇含量在浓度1.0mg/mL达到最高值。pH的测定也表明高浓度胆固醇会抑制菌体生长，培养24h后分别测pH发现，低浓度胆固醇的pH在4.22～4.29之间;高浓度胆固醇的pH则依次为4.48、4.67、4.89，随着胆固醇初始浓度的增高，pH相应降低，菌株生长受抑制程度加深。

图5 ST－Ⅲ的生长曲线与降胆固醇之间的关系

图6 不同胆固醇浓度对胆固醇降解率的影响

3 结论

植物乳杆菌ST－Ⅲ对不同胆盐的耐受力依次为牛磺胆酸钠＞胆酸＞牛胆盐;在培养基中添加不同胆盐植物乳杆菌ST－Ⅲ菌株的降胆固醇能力不同，依次为牛磺胆酸钠＞牛胆盐＞胆酸;当培养基中不添加胆盐时植物乳杆菌ST－Ⅲ菌株具有一定的降胆固醇能力，但作用效果不强;随着培养基中胆盐浓度的增高，植物乳杆菌ST－Ⅲ菌株的降胆固醇能力呈先升高后降低的趋势，当胆盐浓度为3.0g/L时降胆固醇率达到最高值38.57%。

植物乳杆菌ST－Ⅲ菌株具有稳定的降胆固醇能力，对不同来源的胆固醇均具有降胆固醇作用，能力依次为羊血清＞鸡蛋黄＞卵磷脂－胆固醇胶束溶液;在胆固醇浓度对其降胆固醇作用影响的研究发现，当胆固醇浓度低于为0.5mg/mL时，植物乳杆菌ST－Ⅲ菌株的降胆固醇率恒定在40%左右，当浓度高于0.5mg/mL时，降胆固醇能力随着胆固醇浓度的增大而降低;在浓度为1.0mg/mL时，降胆固醇量达到最大值307μg/mL。

植物乳杆菌ST－Ⅲ菌株的降胆固醇作用与菌体生长存在着一定的相关性，菌体生长处于优势则降胆固醇能力强;胆盐的结合状态对植物乳杆菌ST－Ⅲ菌株降胆固醇作用的影响差别较小;这都暗示着植物乳杆菌ST－Ⅲ的降胆固醇作用以同化作用为主，当然这还需进一步实验证实。

［1］Razin S，Kutner S，Efrati H，et al.Phospholipid and cholesterol uptake by mycoplasma cells and membranes［J］.Biochim Biophys Acta，1980，598:628－640.

［2］Gilliland S E，Walker D K.Factors to consider when selecting a culture of lactobacillus acidophilus as a dietary adjunct to produce a hypocholesterolemic effect in humans［J］.J Dairy Sci，1990，73:905－911.

［3］Rudel LL，Morries MD.Determination of cholesterol using οphthalaldehyde［J］.J Lipid Res，1973，14:364－366.

［4］Usman，A Hosono.Bile tolerance，taurocholate deconjugation and binding of cholesterol by lactobacillus gasseri strains［J］.J Dairy Sci，1999，82:243－248.

［5］Liong M T，N P Shah.Acid and bile tolerance and cholesterol removal ability of lactobacilli strains［J］.J Dairy Sci，2005，88:55－66.

［6］吕兵，夏文水，张国农.分离自Kefir的植物乳杆菌体外降胆固醇作用的研究［J］.中国乳品工业，2003(3):3－5.

［7］刘丽莉，董铁有，杨协立.6种乳酸菌降解胆固醇的体外实验［J］.河南科技大学学报:自然科学版，2005(6):85－88.

［8］Klaver F A K，Van Der Meer R.The assumed assimilation of cholesterol by Lactobacilli and Bifidobacterium bifidum is due to theirbile salt deconjugation activity［J］.Applied and Environmental Microbiology，1993，59:1120－1124.

［9］张旻.降胆固醇功能乳杆菌的筛选及降解机理研究［D］.上海交通大学硕士学位论文，2006.

［10］潘道东，张德珍.降胆固醇乳酸菌的筛选及其降胆固醇活性研究［J］.食品科学，2005(5):233－237.

［11］张英春，张兰威，王玉军.分纯益生菌共生及功能特性研究［J］.食品工业科技，2004(8):59－62.

［12］赵丽珺，齐凤兰，陈有容.降胆固醇乳酸菌的初步筛选［J］.上海水产大学学报，2004(2):180－183.

［13］陆晓娜，杨海燕，阿布力米提.新疆马奶酒中降胆固醇乳酸菌的筛选及性状研究［J］.农产品加工学刊，2006(1):31－32.

［14］刘丽莉，夏延斌，唐青春.降胆固醇的乳酸菌筛选研究［J］.食品科学，2004(7):59－62.

［15］柳翰凌，周雨霞，乌尼，等.乳制品中具有降胆固醇功能乳酸菌的体外筛选［J］.乳业科学与技术，2006(1):9－11.

［16］张佳程，骆承庠.乳酸菌对食品中胆固醇脱除作用的研究［J］.食品科学，1998，19(3):20－22.

［17］王素英，王翠英，王敏.耐胆酸盐、降胆固醇乳酸菌的筛选［J］.中国乳品工业，2004(2):14－16.

Study on influence factors of cholesterol removal by Lactobacillus plantarum ST－Ⅲ strain

CHEN Shuai，LIU Juan，WANG Yin－yu，WU Zheng－jun，LIU Zhen－min
(Technical Center，Bright Dairy ＆ Food Co.，Ltd.，Shanghai 200072，China)

TS201.2