hSAMP32基因疫苗的构建及对小鼠生育的影响

石冰涛,刘 锦

(1.河南职工医学院人体结构教研室,河南郑州 451191;2.郑州大学基础医学院解剖教研室,河南郑州 450052)

hSAMP32基因疫苗的构建及对小鼠生育的影响

石冰涛1,刘 锦2

(1.河南职工医学院人体结构教研室,河南郑州 451191;2.郑州大学基础医学院解剖教研室,河南郑州 450052)

目的 构建 hSAMP32避孕疫苗,研究其对小鼠生育率的影响。方法 扩增 hSAMP32基因片段;hSAMP32基因测序;重组质粒 pcDNA3.1(+)-hSAMP32的构建;观察 BALB/c小鼠生殖能力是否受到影响。结果 经对比,目的基因组较对照组穿卵率明显下降。结论 hSAMP32基因可以降低BALB/c小鼠的生殖能力。

hSAMP32;基因枪;pcDNA3.1(+);PGEX-4T3;基因疫苗;RT-PCR

精子膜抗原是精子发生成熟过程中的重要标志分子,与受精和胚胎的早期发育有密切联系,具体涉及精子获能、精卵识别、顶体反应、穿过卵透明带、精卵融合和受精卵的分裂等方面,其中某些抗原能引起机体产生相应的抗体,导致免疫性不孕。开发基于精子膜抗原的避孕疫苗是一条有活力也很有前途的生育调节途径[1-2]。hSAMP32在精卵结合及融合中发挥重要作用,是导致免疫不孕的众多原因之一,诸多研究表明 hSAMP32适合避孕疫苗的研究[3-6]。该实验是通过构建 hSAMP32避孕疫苗,观察其对小鼠生育率的影响。

1 方 法

1.1 逆转录聚合酶链反应 (Reverse Transcription-

Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)扩增 hSAMP32基因片段 根据 GenBank(AF203447)报道的hSAMP32基因序列设计一对引物,在引物的 5’端加上 BamH I和 XhoI酶切位点,以便插入 pcDNA3.1(+)真核表达载体。提取人睾丸组织总 RNA,逆转录 cDNA,PCR扩增目的基因片段。

1.2 hSAMP32基因测序 琼脂糖电泳,回收目的条带,同 T载体连接。转化大肠杆菌 TG1菌株,氨苄青霉素(Amp)和蓝白斑筛选。挑选白色菌落,进行菌落 PCR鉴定和双酶切鉴定,送 TaKaRa公司测序。

1.3 重组质粒 pcDNA3.1(+)-hSAMP32的构建将克隆至 PGEM-T载体的 hSAMP32基因片段用BamH I和 XhoI双酶切后,连接到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,PCR及双酶切鉴定。

1.4 动物实验 用基因枪技术把重组质粒 pcD-NA3.1(+)-hSAMP32导入 BALB/c小鼠股四头肌部位,观察BALB/c小鼠生殖能力是否受到影响。

2 结果

2.1 RT-PCR扩增片段电泳结果 PCR扩增出一条 882bp条带,测序结果与 GenBank(AF203447)报道的基因序列一致,见图 1。

图1 RT-PCR结果

2.2 pcDNA3.1(+)-hSAMP32重组质粒鉴定 双酶切产物经 1%琼脂糖电泳后,在Marker 882bp对应处出现目的条带,见图 2。

图2

2.3 动物实验 hSAMP32目的基因组 BALB/c小鼠 2次基因枪轰击后妊娠率与对照组相比明显下降,同时用鼠抗 hSAMP32血清做穿卵实验明显降低精子穿卵率。

表1 酶联吸附实验结果

鼠抗 hSAMP32血清和 PGEX-4T3-hSAMP32表达蛋白做酶联吸附实验,可见随基因枪轰击次数的增加,小鼠血清内抗体的滴度随之增加。

表2 穿卵实验结果

经对比目的基因组较对照组穿卵率明显下降。

表3 生殖实验结果 (n=9)

第2次基因枪轰击后第4周雄鼠合笼,观察小鼠受孕情况计算妊娠率,妊娠率 =妊娠数∕每组雌鼠数 ×100%,经过对比发现目的基因组生育率明显下降。

3 讨论

该实验用基因枪注射 BALB/c小鼠后,用鼠抗hSAMP32血清做酶联吸附实验和正常血清组对比发现:hSAMP32组 BALB/c小鼠体内产生了针对hSAMP32抗体,而且其浓度随基因枪轰击次数的增加而增加。基因枪轰击后做小鼠合笼生殖实验,发现目的基因组生育效果明显下降。

对于任何用作基因转移的载体,它的安全性都是要首先考虑的。DNA疫苗的载体—质粒 DNA骨架,是来源于细菌的。质粒DNA的免疫原性对于免疫反应的诱发是有利的,但是也存在质粒DNA的免疫原性会不会诱导抗双链 DNA抗体从而引起被免疫动物发生自身免疫性疾病的问题。GirMor[7]等的实验结果表明在 BALB/c小鼠中重复的 DNA免疫可以引起分泌抗 DNA自身 IgG的 B细胞数量增加,但对于血清中自身抗体的水平仅有轻微的影响。

大量的研究表明,质粒DNA的这种免疫原性是安全的,重复免疫并不会诱导抗双链 DNA抗体,也不会出现局部或全身性的副作用。现在普遍认为质粒DNA的细胞内转移也不会引起插入突变。一些学者的研究工作也证明注射质粒DNA是安全的,不会引起质粒 DNA向宿主染色体整合和细胞恶性转变。Macgregor[8]等所做的临床试验工作进一步的证实了DNA疫苗的安全性。

另外一个需要考虑的问题是质粒 DNA的转移会不会引起插入突变。Kurth等通过计算,认为由质粒DNA整合入基因组DNA引起的突变率远远低于个体生命过程中基因组 DNA的自发突变率。Kanellos[9]等的研究表明注射质粒 DNA能够有效的引起针对质粒携带的外源基因表达蛋白的免疫反应而不会引起针对核酸的自身免疫反应,也不会引起质粒DNA向宿主染色体整合。

该实验构建的重组质粒 PGEX-4T3-hSAMP32转化入大肠杆菌 BL21中加入 IPTG诱导后用 SDSPAGE胶电泳得到了明显的目的条带 (59KDa),Western blot分析显示目的基因有明显的表达。真核细胞基因组在原核细胞表达有许多难题,本实验选用的 hSAMP32在大肠杆菌 BL21(DE3)中的到了明显的蛋白表达,实验中所得数值可为今后研究避孕提供一定的理论依据[10-11]。

[1]Naz RK,Sacco A,Singh O,et al.Development of contraceptive vaccines for humans using antigens derived from gametes(spermatozoa and zona pellucida)and hormones(human chorionic gonadotrophin):current status[J].Hum Reprod Update,1995,1(1):1-18.

[2]刘学高.国产避孕疫苗研究现状和前景[J].动物学研究,2000,21(1):23-27.

[3]Abou-HailaA,TulsianiDR,etal.Mammalian sper m acrosome:formation,contents,and function[J].Arch Biochem Biophys,2000;379:173–182.

[4]MylesDG,Hyatt H,Primakoff P,et al.Binding of both acrosomeintac and acrosome-reacted guinea pig sperm to the zona pellucida during in vitro fertilization[J].DevBio,l987,121:559-567.

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[10]刘学高.国产避孕疫苗研究现状和前景 [J].动物学研究,2000,21(1):23-27.

[11]王浩飞,向祖琼,王益鑫.精子膜抗原对抗精子抗体阳性精子顶体酶活性的影响[J].中华男科学杂志,2004.18(2):15-18.

[责任编校:李宜培]

Vaccine for Sperm Acrosomal Membrane-associated Protein32 and Its Impact on Fertility in Mice

SH IBing-tao1,LIU Jin2
(1.Departm ent of Anatom y,Henan Medical College for Staff and Workers,Zhengzhou Henan451191,China 2.Departm ent of Anatom y,Basic Medical College of Zhengzhou University,Zhengzhou Henan450052,China)

Objective To construct hSAMP32 contraceptive vaccine,and to study its impact on fertility in BALB/c mice.Methods The authors amplified gene hSAMP32,sequeuced hSAMP32 gene,reconstructed DNA vaccine(pcDNA3.1(+)-hSAMP32),using gene-gun to put DNA vaccine into BALB/c mice,and observed the BALB/c mice’s reproductive ability.Results The gravidity rate decreased greatly compared to the control group.Conclusion hSAMP32 can be used as immunocontraceptive vaccine to decrease the rate of pregnancy of mouse.

hSAMP32;gene gun;pcDNA 3.1(+);DNA vaccine;RT-PCR

Q 789

A

1008-9276(2010)06-0637-03

2010-06-10

石冰涛 (1979-),男,河南省郑州市人,硕士,助教,从事解剖学教学与研究工作。