基于声表面波器件的仿生嗅觉受体传感器的研究

杜立萍吴春生王 镝王 乐刘清君赵鲁杭王 平*

1)(浙江大学 生物医学工程与仪器科学学院，生物传感器国家专业实验室，杭州 310027)2)(浙江大学 医学院 生物化学与遗传学系，杭州 310058)

基于声表面波器件的仿生嗅觉受体传感器的研究

杜立萍1吴春生1王 镝1王 乐1刘清君1赵鲁杭2王 平1*

1)(浙江大学 生物医学工程与仪器科学学院，生物传感器国家专业实验室，杭州 310027)2)(浙江大学 医学院 生物化学与遗传学系，杭州 310058)

嗅觉受体可以与气味分子发生特异性的相互作用，这一机理不仅在生物嗅觉系统分辨和识别气味的过程中发挥着重要作用，而且也为解决传统嗅觉传感器特异性低的问题提供新的途径。从仿生设计角度，利用嗅觉受体对其配体特异性识别的机理，提高嗅觉传感器的特异性。以嗅觉受体作为敏感元件，声表面波器件作为二级传感器，构建一种可用于特异性气味检测的新型嗅觉受体传感器。选择秀丽线虫嗅觉受体ODR-10作为生物识别元件，通过基因工程的方法，将其表达在人乳腺癌细胞 MCF-7细胞质膜上，提取含有 ODR-10的细胞质膜组分，将其涂覆在声表面波器件的敏感区域。结果表明，ODR-10可以有效地表达于MCF-7的细胞质膜上，用这种异源表达的ODR-10构建的仿生嗅觉传感器对ODR-10的配体丁二酮具有很高的灵敏度，并具有很好的特异性。实验结果证实，这种基于嗅觉受体的仿生嗅觉传感器不仅适用于特异性气味检测，也适用于筛选特异性的嗅觉受体-配体对，将进一步推动嗅觉传导机理研究的进展。

嗅觉传感器;生物传感器;嗅觉受体;气味检测;声表面波

Abstract:High specific interactions between olfactory receptors and odorant molecules play an important role in the discrimination and recognition of various odorants in biological olfactory systems.This mechanism may also provide novel approaches for improving the specificity of conventional gas sensors.Inspired by the biomimic design，this study attempted to improve the specificity of gas sensor by using olfactory receptors as sensitive elements.The novel olfactory biosensor employed the surface acoustic wave(SAW)device as the secondary sensor to detect specific gas molecules.An olfactory receptor protein of C.elegans，ODR-10，was heterologously expressed on the membrane of human breast cancer cell line MCF-7.Then the crude membrane extracts of MCF-7 containing ODR-10 was coated on the sensitive region of SAW.The interactions between ODR-10 and various odorant molecules were monitored by recording the frequency shift of SAW.The experimental results indicated that ODR-10 could be expressed on the membrane of MCF-7 and gas sensors with ODR-10 showed specific responses to diacetyl(2，3-butanedione)，which is known as a natural ligand for ODR-10 receptor.All the results demonstrated that the specificity of gas sensor could be improved by using olfactory receptor proteins.It provides a novel method for improving gas sensing technologies as well as for screening specific olfactory receptor-ligand pairs，which can consequently advance the progress of research on olfactory transduction mechanisms.

Key words:olfactory sensors;biosensor;olfactory receptor;gas detection;surface acoustic wave

引言

气体检测在工业、农业、食品安全、医疗诊断、环境监测等领域都有重要的应用，促进了气敏传感器以及电子鼻检测系统的快速发展，尤其是电子鼻系统已经得到了系统的研究和广泛的应用［1］。作为气体检测的最基本元件，当前大部分气敏传感器都是基于传感器表面涂覆特殊的材料来进行气体检测，如金属氧化物［2］、导电聚合物［3］、超分子化合物、无机物膜材料、分子液晶等，这些敏感膜材料普遍存在的问题是特异性差。1998年，Gopel首次提出生物电子鼻的概念，将生物材料直接作为气体检测的敏感材料，模拟天然生物嗅觉系统构建检测气体的电子鼻系统［4-6］。

生物的嗅觉系统具有高度的灵敏度和特异性，这得益于生物进化过程中形成的完备的传感基础和机制。2004年，诺贝尔生理学或医学奖获得者Buck和Axel克隆出嗅觉受体基因超家族，为嗅觉产生机理的研究做出了巨大贡献［7］。嗅觉信号产生的第一级在嗅黏膜上，那里存在大量的嗅觉神经元细胞，每个嗅觉神经元上都表达有唯一的嗅觉受体蛋白(olfactory receptor proteins，ORPs)，而每种嗅觉受体蛋白只能选择性地与特定的一种或几种配体分子结合，之后偶联细胞膜上的G蛋白，引起细胞内第二信使的产生，相应离子通道的开放引起嗅觉神经元产生动作电位，这样气味化学信号被转换为电信号［8］。随后电信号被传导至上级的神经系统进行进一步的信息编码与处理，最终形成嗅觉。嗅觉受体与气味分子的特异性结合是嗅觉系统特异性的重要生物基础，因而具有重要的意义。许多学者探索利用生物材料天然的敏感性来构建用于气体检测的电子鼻系统，如嗅神经元细胞［9］、表达有嗅觉受体的酵母［10］、嗅觉受体［11-12］等，取得了一定的成果。

本研究构建特异性的仿生气敏传感器，模拟生物嗅觉系统特异性识别气体的过程，探索将嗅觉受体与气味分子特异性结合的特性直接应用于新型的气敏传感器的构建［13］。选择线虫的嗅觉受体ODR-10作为传感器的生物识别元件(已知其天然配体是丁二酮)，通过基因工程的方法获得这种受体蛋白，经过生物方法的鉴定后，将其与声表面波传感器耦合，实现气体的检测与分析。

1 实验材料

ODR-10 基因质粒 pBluescript SK-/odr-10，由美国洛克菲勒大学 Bargmann教授提供;MCF-7细胞系;PCR和 RT-PCR引物，由 TaKaRa公司合成;dNTP及逆转录酶，购于TaKaRa公司;Trizol，购于南京凯基生物;激光共聚焦显微镜;声表面波器件及检测系统。

2 实验方法

2.1 质粒构建

首先通过 PCR的方法从质粒 pBluescript SK-/odr-10 中获得 odr-10 的基因序列，其中前向引物 5′-GAGTTGGAATTCATGTCGGGAGAATTGTGG-3′，反向引物为5′-CAGTAAGGATCCCGCGTCGGAACTT GAGACAAATT-3′。信号肽基因rho-tag的序列从NCBI中查得，由 TaKaRa公司合成，用限制性核酸内切酶HindⅢ和EcoRⅠ，将其插入pFLAG-CMV-3表达载体的多克隆位点中，然后将线虫嗅觉受体基因序列 odr-10 插入 pFLAG-CMV-3/rho-tag 的 EcoR I和BamH I之间，从而获得表达质粒 pFLAG-CMV-3/rho-tag/odr-10。构建成功后，对质粒序列进行测序鉴定。

2.2 MCF-7细胞培养与转染

MCF-7细胞培养在添加了10%胎牛血清、青霉素(100 U/mL)和链霉素(100 μg/mL)的 DMEM 培养基中，于37℃、含5%CO2的培养箱中进行培养。转染之前，细胞被接种于六孔培养皿中并孵化一天。转染试剂为含有 pFLAG-CMV-3/rho-tag/odr-10的lipofectamin 2000试剂。转染后的细胞使用G418(800 mg/L)进行稳定株的筛选。

2.3 嗅觉受体的生物鉴定

2.3.1 免疫细胞化学

通过使用连接有 FITC的 ANTI-FLAG M2单克隆抗体，检测融合蛋白FLAG的表达，表征嗅觉受体ODR-10在细胞膜上的定位情况。为进行荧光显微镜的观察，先将转染的细胞种在6孔板中，再用甲醇:丙酮(1∶1)混合液固定1 min，室温下将抗体孵育1 h。然后冲洗细胞，使用激光共聚焦显微镜观察，吸收波长492 nm，最大发射波长520 nm。

2.3.2 RT-PCR

使用RT-PCR的方法，实现在 mRNA水平鉴定嗅觉受体的表达。使用 Trizol提取总 RNA，然后进行逆转录，以随机六聚引物PrimeScriptTMRTase(200 U/μL)为逆转录酶，在42℃反应1 h。然后，在50 μL反应体系中加入2 μg的逆转录产物作为模板进行 PCR扩增，上 游引物序 列为5′-GTCGCAGGATCCTCGAGATGAACGGGACCGAGGGC-3′，下游引物序 列 为5′-CAGTAAGGATCCCGCGTCGGAACTTGA GACAAATT-3′:首先 94℃ 预变性 5 min，再以 94℃× 1 min、55℃× 50 s、72℃× 80 s、40个循环扩增，最后72℃×5 min。PCR产物在含有 ethidium bromide的2%琼脂糖凝胶中电泳，通过紫外成像系统观察电泳条带。

2.4 嗅觉受体蛋白的粗提取

经过筛选的稳定株细胞用PBS清洗后从培养瓶中收获。收获的细胞用超声波探头超声5 min，然后16 000 g离心40 min。浮在表面的是细胞溶质部分，小球是膜部分。浮在表面的部分用丙酮沉淀，沉淀物和5倍的尿素标本缓冲液混合。小球用含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒的细胞裂解液在冰冻条件下溶解30 min。然后，将5倍的尿素样品缓冲液加入到溶解的小球溶液中，即可获得粗提的膜蛋白，其中含有表达于膜上的嗅觉受体蛋白ODR-10。

2.5 传感器的构建与检测

采用双通道延迟线型声表面波器件作为换能器，通过检测嗅觉受体与气体结合过程中的质量变化情况，实现气体的特异性检测。声表面波器件采用旋转128°Y切 X传播的 LiNbO3基片。其中，一个通道作为参比通道，中心频率为120.1 MHz;另一个通道作为检测通道，中心频率为119.6 MHz。传感器带宽为0.9 MHz，Q值为133.5，传感器结构如图1所示。在双通道SAW延迟线振荡器结构中，一个通道的SAW传播路径被气敏薄膜所覆盖而用于测量，另一通道未覆盖薄膜而用于参考。两个振荡器的频率经混频取差额输出，以实现对共模干扰自补偿。

骆塞夫先生《向阳与背阴》由树讲到人，背阴者生活艰辛，然，不甘平庸者以百倍于他人的努力，最终成材、成才；向阳者生活条件好，若借此机会养尊处优不肯努力，最终也难成栋梁之才。揭示的就是有利因素和不利因素在一定的条件下，都向各自相反的方向转化的辩证关系。

在实验中，首先将含有 ODR-10受体的细胞膜蛋白采用滴涂法沉积于声表面波器件的敏感区域，待膜彻底干燥后进行检测。受体蛋白对气体的特异性吸附引起声表面波器件敏感区域的质量改变，输出的频率改变与质量变化成正比。声表面波器件的输出频率变化与敏感区域的质量变化之间的关系为

图1 双通道延迟线型声表面波传感器结构Fig.1 Schematic diagram of dual-channel delay line surface acoustic wave sensor

式中，Δf是检测前后输出频率的变化值，Δm是敏感区域的质量变化，f0是声表面波器件检测前的频率，A为敏感区的面积，k是声表面波器件敏感材料的基质系数。

根据实验中涂覆的敏感膜不同，将实验分为3组:一为含嗅觉受体膜蛋白的传感器组，敏感膜使用含有ODR-10受体的细胞膜蛋白;二为不含嗅觉受体膜蛋白的传感器组:敏感膜为不含有 ODR-10受体的细胞膜蛋白;三为无任何膜蛋白的传感器组，声表面波敏感区不涂覆任何敏感膜材料。这三组传感器分别对空气、乙醇、丁二酮3种气体进行测定，以检测其响应。实验中每种气体各2 mL，且要求保证气体具有恒定的流速。

此外，为确定含有嗅觉受体膜蛋白的传感器对ODR-10受体的天然配体是否有特异性响应，以几种与丁二酮结构相似的气体作为被测气体，分别是戊二酮、丁醇、乙醇，检测传感器的输出响应。

3 实验结果

3.1 pFLAG-CMV-3/rho-tag/odr-10表达质粒的构建

ODR-10表达质粒结构如图2所示，其中引导肽是rho-tag，用于引导表达的 ODR-10定位到细胞的质膜上;FLAG蛋白用于免疫标记鉴定，以观察ODR-10是否表达在细胞的质膜上。构建好的质粒pFLAG-CMV-3/rho-tag/odr-10 经酶切后进行凝胶电泳，结果如图3所示;再经测序鉴定，表明所构建的表达质粒正确。

3.2 嗅觉受体蛋白ODR-10在MCF-7细胞质膜上的表达

为了进一步鉴定嗅觉受体蛋白在异源细胞系统MCF-7的表达情况，采用 RT-PCR的方法测定受体蛋白ODR-10在 mRNA水平上的表达情况，结果如图5所示。在1 kb位置上，可以看见一条特别明亮的条带，与理论位置相符，证明了嗅觉受体蛋白在mRNA水平上有显著的表达。

图2 pFLAG-CMV-3/rho-tag/odr-10质粒结构Fig.2 Schematic diagram of the constructed plasmid pFLAG-CMV-3/rho-tag/odr-10

图3 pFLAG-CMV-3/rho-tag/odr-10酶切后电泳鉴定结果。M，DNA标记;泳道1，经HindⅢ和EcoRⅠ酶切后的质粒 pFLAG-CMV-3/rho-tag/odr-10，泳道 2，经ECoRⅠ和BamHⅠ酶切后的质粒pFLAG-CMV-3/rho-tag/odr-10，泳道3:经 HindⅢ和 BamH I酶切后的质粒 pFLAG-CMV-3/rho-tag/odr-10;泳道 4，未经酶切的质粒pFLAG-CMV-3/rho-tag/odr-10Fig.3 Gel electrophoresis of pFLAG-CMV-3/rho-tag/odr-10 digested by restricted enzymes.Lane M:DNA size marker;Lane 1:pFLAG-CMV-3/rho-tag/odr-10 digested by HindⅢand EcoRI;Lane 2:pFLAG-CMV-3/rho-tag/odr-10 digested by ECoRI and BamHI;Lane 3:pFLAG-CMV-3/rho-tag/odr-10 digested by HindⅢand BamHI;Lane 4:pFLAG-CMV-3/rho-tag/odr-10 was not digested

3.3 声表面波传感器的响应

图4 免疫细胞化学结果。(a)荧光视野;(b)可见光视野Fig.4 The result of the immunocytochemistry.(a)florenscence field;(b)optical field

图5 RT-PCR结果Fig.5 The result of RT-PCR

实验中用3组声表面波传感器对空气、乙醇、丁二酮3种气体进行测试，其中乙醇和空气是对照性气体，实验数据处理后的结果如图6所示。Δf=f′-f0，其中f0是每组传感器的静态频率输出值，f′测试气体以一定速度流经传感器表面时引起的频率输出值，故Δf是传感器对一定流速的测试气体的响应值。Δf′传感器对一定流速的空气的响应值，用Δf′对 Δf做数据归一化处理(即 Δf/Δf′)，以排除气流干扰等环境因素引起的传感器非特异性响应。

图6 传感器输出响应Fig.6 The output of the sensor

1)在含有嗅觉受体膜蛋白的传感器组中，传感器对丁二酮的响应显著高于对乙醇的响应，P=0.009 177(P＜0.01，n=5)，二者具有显著性差异。

2)对于丁二酮的响应，含 ODR-10嗅觉受体膜蛋白传感器的响应显著高于不含ODR-10受体膜蛋白的传感器组，P=0.000 454 7(p＜0.001，n=5)，具有极显著差异;同时也极显著高于没有敏感膜的传感器组的响应，P=0.000 146(P＜0.001，n=5)。

综合1)和2)可知，基于嗅觉受体的声表面波传感器对丁二酮的特异性响应是由于嗅觉受体ODR-10的存在引起的。

3)对于乙醇的响应，两组涂有膜蛋白的传感器组无显著性差异，P=0.331 503(P＞0.05，n=5);而与没有敏感膜的传感器组存在显著性差异，P=0.002 195(P＜0.01，n=5)。这说明两组涂有膜蛋白的传感器对乙醇的响应是其他膜蛋白成分对乙醇的非特异性吸附作用引起的。

4)在无嗅觉受体的膜蛋白组的实验中，传感器对乙醇的响应极显著地高于对丁二酮的响应，P=0.000 799 3(P＜0.001，n=7);而在没有敏感膜的一组中，传感器对乙醇和丁二酮两种气体的响应相当，并无显著性差异 P=0.261 622(P＞0.05，n=5)。这说明，膜对丁二酮也有一些非特异性吸附作用，但是弱于对乙醇的非特异性吸附。

以上结果说明，异源表达的嗅觉受体蛋白ODR-10保持了天然嗅觉受体蛋白具有的对其配体丁二酮的特异识别能力，并且可以作为敏感元件与二级传感器结合，构成气敏生物传感器。

以这种基于嗅觉受体蛋白的声表面波传感器为检测元件，对丁二酮、戊二酮、丁醇、乙醇4种气体分别进行检测，其中控制实验条件相同，响应的结果如图7所示。可以看出，此传感器对与丁二酮分子结构略有差别的几种气体没有特异性的响应，进一步验证了嗅觉受体与二级敏感元件结合作为气敏生物传感器的可行性。

图7 基于嗅觉受体的声表面波气体传感器对气体的响应Fig.7 The responses of the receptor-based gas sensor to several gases

4 讨论与结论

传感器特异性的检测能力取决于特殊生物敏感材料的选取，然而获得具有生物活性的嗅觉受体蛋白的工作是比较困难和复杂的，这成为仿生嗅觉传感器研制中的关键。因此，寻找简单有效的方法制备嗅觉受体蛋白具有重要的意义。除本研究所叙述的方法外，无细胞蛋白质合成系统是一种更为方便快捷的蛋白制备手段［14］，它是在体外以外源的mRNA或DNA为模板，在细胞抽提物的酶系中合成蛋白质的体外系统。与传统的体内蛋白质表达系统相比，无细胞系统具有显著的优点，如反应简便快速、获得的蛋白质纯度较高等。因而，无细胞蛋白质合成技术能够为基于嗅觉受体的生物传感器研制提供纯度较高的嗅觉受体，从而可有效提高传感器的特异性及灵敏度。此外，嗅觉受体在二级传感器表面上的有效固定也对传感器的性能有重要影响，因而寻找更有效的方法将受体蛋白固定在传感器表面是十分重要的，如采用共价连接、交联连接等。

基于嗅觉受体对气味分子的特异性识别机理，笔者以异源表达的嗅觉受体蛋白作为敏感元件，以声表面波器件作为二级传感器，构建了一种新型嗅觉传感器，并证实了应用嗅觉受体蛋白提高气味传感器特异性的方法，同时也初步探索了使用异源表达的嗅觉受体作为生物敏感元件构建生物传感器的可行性。实验结果证实，该方法获得的嗅觉受体能够特异性地识别其天然配体，这为基于受体的仿生嗅觉传感器的进一步研究奠定了基础，同时也能够为仿生电子鼻的发展提出一种新的思路，并可能在临床上得到应用，如用于肺癌患者呼出气体的诊断分析。此外，这种基于嗅觉受体的气体传感器还可能用于嗅觉受体-配体对的研究，作为一种筛选工具来筛选某些受体对应的配体，为嗅觉机理的研究提供一种新的研究手段。

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The Study of Bionic Olfactory Receptor Sensor Based on Surface Acoustic Wave Device

DU Li-Ping1WU Chun-Sheng1WANG Di1WANG Le1LIU Qing-Jun1ZHAO Lu-Hang2WANG Ping1*
1)(Biosensor National Special Laboratory，Department of Biomedical Engineering，Zhejiang University，Hangzhou 310027，China)2)(Department of Biochemistry and Genetics，School of Medicine，Zhejiang University，Hangzhou 310058，China)

R318

A

0258-8021(2010)04-0601-06

10.3969/j.issn.0258-8021.2010.04.020

2010-03-06，

2010-04-27

国家杰出青年科学基金(60725102);国家自然科学基金资助项目(30700167)

*通讯作者。 E-mail:cnpwang@zju.edu.cn