周围神经损伤后神经组织中Par-3蛋白表达和分布的变化

万丽丹刘厚奇丁文龙

(1上海交通大学医学院解剖学教研室,上海200025;2南昌大学医学院解剖学教研室,南昌330006;3第二军医大学组织胚胎学教研室,上海200433)

周围神经损伤后神经组织中Par-3蛋白表达和分布的变化

万丽丹1,2刘厚奇3丁文龙1＊

(1上海交通大学医学院解剖学教研室,上海200025;2南昌大学医学院解剖学教研室,南昌330006;3第二军医大学组织胚胎学教研室,上海200433)

目的 观察极性蛋白Par-3在损伤后神经组织中的表达和分布,探讨Par-3蛋白在周围神经损伤后髓鞘再生中的作用。方法 32只Sprague Dawley大鼠随机分为正常对照组、损伤组(坐骨神经损伤后第1、2、4、8周)。制备坐骨神经挤压伤模型,分别于损伤后各时间点,采用免疫组织化学法检测坐骨神经损伤远端Par-3蛋白的表达和分布。结果正常大鼠坐骨神经组织中即存在Par-3蛋白,但表达量少,且仅分布于Schwann细胞核内。坐骨神经损伤后,Par-3蛋白的表达和分布发生变化。损伤后1周,Par-3蛋白表达开始升高,Par-3散在分布于Schwann细胞核和细胞浆内。损伤后2周,神经组织中的Par-3蛋白达峰值,在Schwann细胞浆内呈不对称性分布似包绕轴突,呈新月形或C形。损伤后4周和8周,Par-3蛋白表达显著降低,神经组织中Par-3蛋白主要分布于Schwann细胞核内,胞浆内很少。结论 极性蛋白Par-3可能参与周围神经损伤后Schwann细胞的髓鞘再生。

周围神经损伤;髓鞘形成;细胞极性;Par-3

髓鞘的形成有赖于神经胶质细胞内细胞器的两极分化,这种高度极性化需要细胞极性蛋白的参与[1,2]。Chan等人[3]研究发现细胞极性蛋白 Par-3在Schwann细胞浆内面向轴突的不对称性分布,是BDNF介导的启动髓鞘形成的结构基础。但是,周围神经损伤后Schwann细胞中极性蛋白Par-3的表达和分布的变化,国内外尚未见报道。本研究通过观察坐骨神经损伤后不同时间点,神经组织中Par-3蛋白的表达和分布的变化,明确极性蛋白Par-3与髓鞘再生的关系,可能为损伤或疾病后的髓鞘形成提供形态学依据。

材料和方法

1.材料

Par-3山羊抗多克隆抗体(1:400)和 FITC结合的驴抗山羊 IgG抗体(1:1000)购自 Santa Cruz公司;驴抗山羊IgG抗体(1:1000)购自上海康成生物工程公司;Hochest购自Sigma公司;RIPA裂解液购自上海生工。倒置相差显微镜DMI4000B(Leica公司)。成年雌性Sprague Dawley大鼠(220-240g)32只由中科院上海生命科学研究院动科所提供。

2.坐骨神经损伤模型的制作[4]与分组

大鼠经1%戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔麻醉后,背部朝上固定于手术台上。右后肢剃毛,75%酒精消毒腿部皮肤,沿大腿外侧作纵切口,暴露臀部肌肉,游离坐骨神经(长约10-15 mm)。使用无齿止血钳上一个扣在坐骨神经中上部钳夹,保持30 sec,在同一位置,止血钳与前一次垂直再钳夹30 sec,两次钳夹间隔1 min。术后,逐层缝合右后肢肌肉与皮肤。每只动物左后肢未施行手术作为正常对照组。动物分别饲养1,2,4和8周后取材。大鼠随机分为正常对照组(n=32)和损伤组(n=32)。损伤组随机分为损伤后1、2、4、8周共4组,每组各8只。免疫组织化学法染色观察各组神经组织Par-3蛋白的表达和分布。

3.Western blotting

每组损伤远端神经组织以RIPA裂解后提取总蛋白,样品定量后变性处理,经聚丙烯酰胺电泳后转膜。TBST洗膜后用5%无脂牛奶室温封闭1 h,再加入Par-3山羊抗多克隆抗体(1:400)室温孵育2 h。TBST洗去未结合的多余抗体后,加入驴抗山羊IgG(1:1000)室温孵育1 h。ECL显影,定影。GAPDH作为内参。每组样品重复实验3次。

4.免疫组织化学法

各组实验动物大鼠腹腔麻醉后,经左心插管灌注200 ml生理盐水,继续灌注4%多聚甲醛的磷酸缓冲液(p H7.4)200 ml,持续1.5 h。取双侧坐骨神经损伤远端1-2 mm处的神经组织,置于20%蔗糖磷酸液中,4°C过夜,做常规石蜡切片显示坐骨神经横切面,免疫组织化学法显示神经组织中Par-3的表达和分布。操作过程如下:1:20正常羊血清用0.3%Triton X-100的TBS稀释孵育标本24h,4°C。山羊抗Par-3抗体(1:200)孵育标本48 h,4°C。0.01mol/LPBS洗3次,每次10 min。FITC结合的驴抗山羊 IgG(1:200)孵育标本4 h,37°C,避光。Hoechst染核,荧光封片剂封片,镜下观察拍照。

5.统计学处理

结 果

图1A显示正常对照组及损伤后各时间点,坐骨神经组织中Par-3蛋白的表达情况。与正常组相比,损伤后1,2,4和8周Par-3的表达均高于正常组(＊P<0.05,＊＊P<0.01,＊＊＊P<0.001,图1B)。神经损伤后各时间点,Par-3的表达呈现先升高而后迅速下降的趋势,峰值出现在损伤后2周左右。损伤后期神经组织中Par-3的表达较损伤早期已显著降低,损伤后8周Par-3的表达已和正常对照组基本无异(P>0.05,图1B)。

图1 Par-3蛋白在坐骨神经组织中的表达A.神经组织中 Par-3蛋白表达的 westem blotting结果。B.各组Par-3蛋白表达的统计学分析。Normal:正常对照组.IW:损伤后1周.2W:损伤后2周.4W:损伤后4周.8W:损伤后8周.＊＊1Wvs Normal,P<0.01,＊＊＊2Wvs NormalP<0.001,＊4Wvs Normal,P<0.05,8Wvs Normal,P>0.05.Fig.1 The expression of Par-3 protein in the sciatic nervesA.The expression of Par-3 protein in nerve tissues was examined by western blotting;B.The statistical analysis of Par-3 expression in each group.Normal:Normalgroup.1W:One week postinjury.2W:Two weeks postinjury.4W:Four weeks postinjury.8W:Eight weeks postinjury.＊＊1Wvs Normal,P<0.01,＊＊＊2Wvs Normal,P<0.001,＊4Wvs Normal, P<0.05,8Wvs Normal,P>0.05.

图2 Par-3蛋白在坐骨神经组织中的表达和分布 ×400;1.正常对照组 2.损伤后1周 3.损伤后2周 4.损伤后4周 5.损伤后8周。A.Par-3的FITC免疫萤光染色。B.Hoechst染核C.融合。Fig.2 The expression and distribution of Par-3 protein in the sciatic nerves×400;1.Normal 2.One week post injury 3.Two weeks post injury 4.Four weeks post injury 5.Eight weeks post injury;A.Par-3 immunofluorescence staining;B.Neuclei dyed by Hoechst;C.Merge

图2为Par-3蛋白在各组神经组织中的分布情况。正常对照组神经组织中显示 Par-3荧光的Schwann细胞数量很少,且只位于Schwann细胞核内(图2-1A)。损伤后1周和2周,神经组织中Par-3荧光强度显著增强,提示 Par-3蛋白表达增强,Schwann细胞胞浆和胞核内均有分布。损伤后1周,Par-3蛋白均匀散在分布于Schwann细胞胞核和胞浆内(图2-2A)。损伤后2周,Schwann细胞浆内Par-3蛋白的分布呈新月形,C形或S形的不对称性分布(图2-3A),似与轴突接触或包绕轴突。损伤后4周(图2-4A)和8周(图2-5A),神经组织中 Par-3的表达显著降低,且主要分布于Schwann细胞核内,Schwann细胞浆内Par-3的不对称性分布显著减少。损伤后4周对比损伤后8周,神经组织内尚存在少量Par-3蛋白呈不对称性分布的Schwann细胞。图3为Par-3蛋白在单个视野内的分布面积和分布密度的统计学分析(＊P<0.05,＊＊＊P<0.001)。

图3 Par-3蛋白在单个视野内的分布面积和分布密度的统计学分析;Normal:正常对照组.1W:损伤后1周.2W:损伤后2周.4W:损伤后4周.8W:损伤后8周.Fig.3 The statistical analysis of Par-3 distribution area and density within a visual field;Normal:Normal group.1W:One week postinjury.2W:Two weeks postinjury.4W:Four weeks postinjury.8W:Eight weeks postinjury;＊＊＊1Wvs Normal,P<0.001;＊＊＊2Wvs Normal,P<0.001;＊4Wvs Normal,P<0.05;8Wvs Normal,P>0.05.

讨 论

极性蛋白Par-3可位于细胞膜、细胞核和细胞浆中[5]。位于Schwann细胞膜上的Par-3主要参与髓鞘施琅切迹及paranodal loop处紧密连接的形成,结合其他连接蛋白保证大分子物质在髓鞘内的正常分布,避免髓鞘外环境对髓鞘内部的干扰,维持着髓鞘内环境的稳定,确保髓鞘的绝缘性以及神经冲动正确有序的传导[6]。位于 Schwann细胞浆中的Par-3就像一个分子支架,将形成髓鞘所需的关键蛋白质集合起来,同时这个支架还是轴突信号的受体[3]。Schwann细胞必须形成极性,才能判断细胞的哪一侧和轴突接触了,而Par-3是Schwann细胞极性化的分子基础。当这个支架被打乱后,细胞就不能形成正常的髓鞘[3]。

本实验中,损伤早期,Par-3蛋白强表达,同时分布于Schwann细胞胞浆和胞核内。损伤晚期, Par-3蛋白表达明显减少,基本只位于Schwann细胞核内。损伤后2周,Schwann细胞浆内Par-3蛋白的分布尤其特别,呈不对称性分布,似与轴突接触或包绕轴突。由于髓鞘形成是Schwann细胞变形,包绕轴突的过程,因此我认为胞浆内Par-3蛋白分布的变化是Schwann细胞极性化以及髓鞘形成的关键,而胞核内Par-3的存在,可能是一种蛋白储备,一旦轴突脱髓鞘,胞核内的Par-3即被动员出来,移至胞浆。Par-3蛋白表达和分布的变化可能是由于Schwann细胞感受到与轴突失去联系,通过某种胞内信号通路,上调Par-3的表达,还促使Par-3由胞核向胞浆转移。离体实验[3]表明单纯培养的Schwann细胞,胞浆内Par-3弥散分布,或在相邻Schwann细胞的接触部位呈线形分布,不呈新月形或C形分布。因此,Par-3蛋白从胞核运至胞浆后是否在胞浆呈不对称性分布,必须以Schwann细胞是否接触到轴突为前提。本实验中,损伤后1周,大部分再生轴突尚未穿过损伤部位到达损伤远端,Schwann细胞浆内Par-3蛋白在胞浆和胞核内分布均匀,无极性,不对称性分布尚不明显。损伤后2周,轴突再生并跨越损伤部位达到损伤远端,Par-3蛋白同时存在于胞核和胞浆内,并在胞浆内呈不对称性分布。但是,尽管损伤后4周和8周,损伤远端存在轴突,Par-3蛋白的这种不对称性分布却未观察到。初步判断极性蛋白Par-3对于Schwann细胞启动成髓,即Schwann细胞识别轴突后进行第一层包绕,至关重要。一旦Schwann细胞完成了对髓鞘的第一层包绕,Par-3将迅速返回胞核内。而剩余的同心圆性包绕,可能是一种惯性,这种惯性至少包含了细胞骨架的不断延伸,及Schwann细胞相邻胞膜间紧密连接的共同维持,至少主要不是由Par-3在Schwann细胞和轴突相邻面形成的支架来维持的。当然,维持髓鞘形成也包含了各类与髓鞘形成有关的物质如髓鞘蛋白和膜脂质的不断合成。不得不提的是,本实验动物模型为坐骨神经挤压伤,损伤程度较轻,因此观察周数较短,Par-3蛋白在Schwann细胞内出现不对称性分布的时间点为损伤后2周左右。但是,对于其他不同类型和程度的周围神经损伤后的髓鞘再生,Schwann细胞内出现Par-3不对称性分布的时间点或许会不同于本实验显示的结果,这种区别主要由于不同损伤后再生轴突跨越损伤部位所需的时间不同。

Par-3蛋白在Schwann细胞浆内呈极性分布的意义可能在于,当神经组织中存在高浓度BDNF时,牵引Schwann细胞膜表面的p75NTR向高浓度BDNF趋向性转移,通过结合于Par-3的PDZ区, p75NTR被固定于 Schwann细胞膜面向轴突的那一侧,形成了p75NTR-Par-3复合体在 Schwann细胞的极性分布。通过该复合体,Schwann细胞可准确感受与之相接触的轴突所释放BDNF水平的高低,并对此作出适应性反应,最终表现不断合成与髓鞘形成有关的一系列物质,这一推论有望在今后的实验中进一步证实。另外,其他神经营养因子在髓鞘形成与损伤后的髓鞘再生中发挥重要作用[7,8],它们与Schwann细胞中 Par-3的表达与分布之间的关系也值得深入探讨。

[1]Etienne-Manneville S.Polarity proteins in glial cell functions.Curr Opin Neurobiol,2008,18(5):488-494

[2]Maier O,Hoekstra D,Baron W.Polarity development in oligodendrocytes:sorting and trafficking of myelin components.J Mol Neurosci,2008,35(1):35-53

[3]Chan JR,Jolicoeur C,Yamauchi J,et al.The polarity protein Par-3 directly interacts with p75NTRto regulate myelination.Science,2006,314(5800):832-836

[4]Zhang J Y,Luo XG,Xian CJ,et al.Endogenous BDNF is required for myelination and regeneration of injured sciatic nerve in rodents.Eur JNeurosci,2000,12(12):4171-4180

[5]Assémat E,Bazellières E,Pallesi-Pocachard E,et al.Polarity complex proteins.Biochim BiophysActa, 2008,1778(3):614-630

[6]Poliak S,Matlis S,Ullmer C,et al.Distinct claudins and associated PDZ proteins form different autotypic tight junctions in myelinating Schwann cells.J Cell Biol, 2002,159(2):361-372

[7]Chan JR,Cosgaya JM,Wu YJ,et al.Neurotrophins are key mediators of the myelination program in the peripheral nervous system.Proc Natl Acad Sci U S A, 2001,98(25):14661-14668

[8]Rosenberg SS,Ng BK,Chan JR.The quest for remyelination:A new role for neurotrophins and their receptors.Brain Pathol,2006,16(4):288-294

EXPRESSION AND DISTRIBUTION OF PAR-3 PROTEIN IN PERIPHERALNERVE TISSUES AFTER INJURY

Wan Lidan1,2＊,Liu Houqi3,Ding Wenlong1＊
(1Department of A natomy,School of Medicine,S hanghai J iaotong University,S hanghai200025;2Department of A natomy,Medical School,N anchang University,N anchang330006;3Department ofHistology and Embryology,The Second Military Medical University,Shanghai200433,China)

Objective To observe the expression and distribution of the polarity protein Par-3 in nerve tissues after peripheral nerve injury,and to investigate the role of Par-3 protein in Schwann cell myelination.Methods 32 Sprague-Dawley rats were randomly divided into a control group and experimental groups,the latter was subdivided into 1,2,4 and 8-week groups after sciatic nerve injury.The expression and distribution of Par-3 in sciatic nerve tissues distal to the injury site was examined by using immunohistochemistry.Results Par-3 protein existed in the normal sciatic nerve tissues,but in small quantities,and only localized in Schwann cell nucleus.After sciatic nerve injury,the expression and distribution of Par-3 protein changed.At 1 week post injury,Par-3 protein in Schwann cells began to increase,scattered in both the nucleus and the cytoplasm within Schwann cells.At 2 weeks post injury,Par-3 protein reached a peak expression and was asymmetrically distributed in the cytoplasm within Schwann cells surrounding axons,exhibiting a half-moon or C-shape.At 4 and 8 weeks post injury,the expression of Par-3 protein was markedly reduced,mainly found in Schwann cell nucleus,but rarely in the cytoplasm.Conclusion Our findings suggest that the polarity protein Par-3 may play a role in Schwann cell remyelination after peripheral nerve injury.

Peripheral nerve injury;Myelination;Cell polarity;Par-3

R322.85

A

10.3870/zgzzhx.2010.04.004

2010-01-15

2010-04-20

上海市重点学科建设项目(S30201)南昌大学博士科研基金。

万丽丹,女(1980年),汉族,博士,讲师

＊通讯作者(To whom correspondence should be addressed)