丝胶预处理对糖尿病大鼠睾丸IGF-1表达的影响

付文亮 钟美蓉 和亚强 宋成军 陈志宏

(承德医学院解剖学教研室,河北 067000)

丝胶预处理对糖尿病大鼠睾丸IGF-1表达的影响

付文亮 钟美蓉 和亚强 宋成军 陈志宏＊

(承德医学院解剖学教研室,河北 067000)

目的 探讨丝胶预处理对2型糖尿病大鼠睾丸胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)表达的影响。方法 30只雄性SD大鼠随机分为3组(n=10):正常对照组、糖尿病模型组和丝胶预处理组。链脲佐菌素连续腹腔注射制作2型糖尿病大鼠模型,以血糖≥16.7mmol/L作为成模标准;丝胶预处理组大鼠在注射链脲佐菌素前给予丝胶灌胃(2.4g/kg/d)35d。采用葡萄糖氧化酶法检测血糖,采用ELISA方法检测大鼠血清睾酮和IGF-1水平;分别采用免疫组化染色和RT-PCR法检测睾丸IGF-1蛋白和mRNA的表达。结果 丝胶预处理可明显抑制糖尿病大鼠血糖升高,血清睾酮、IGF-1水平的降低,睾丸IGF-1表达的下降(丝胶预处理组与糖尿病模型组比较:P<0.01)。结论 丝胶预处理可通过阻止糖尿病大鼠睾丸IGF-1表达的下调,改善生精功能,发挥对糖尿病生殖功能损害的预防保护作用。

丝胶;糖尿病;睾丸;胰岛素样生长因子-1;预处理

胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)是由70个氨基酸组成的多肽,在结构上与胰岛素有高度的同源性,除了介导生长激素的作用外,对代谢有着类胰岛素样作用[1-2]。最初的研究发现,IGF-1由肝脏合成和分泌;目前,在肾、肺、胸腺、睾丸和脑等多种器官也发现有IGF-1的存在[3]。IGF-1与雄性生殖密切相关,可通过下丘脑-垂体-睾丸轴的各个层面发挥对雄性内分泌功能的调控作用;IGF-1基因突变的雄性小鼠出现身体、中枢神经系统发育异常以及生殖器官发育迟缓和生殖功能减退[4]。丝胶约占蚕茧的30%,是茧丝中具有多种生物活性的水溶性蛋白质,本文观察了丝胶预处理对2型糖尿病大鼠睾丸IGF-1表达的影响,为防治糖尿病生殖功能减退开辟新思路。

材料和方法

1.材料

丝胶为彩色蚕茧经浸泡、水煎、过滤、浓缩而成。链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ),美国Sigma公司;检测血清睾酮的 ELISA试剂盒,武汉中美科技有限公司;检测血清 IGF-1的 ELISA试剂盒,武汉博士德生物工程公司;兔抗IGF-1多克隆抗体,武汉博士德生物工程有限公司;Trizol,美国 Invitrogen公司;IGF-1引物由上海生工公司合成;一步法RT-PCR试剂盒,大连宝生物工程有限公司;蓝色预染蛋白质Marker(低)、600bp DNA Ladder,北京泰格美科技有限公司。

2.方法

2.1 实验动物的分组及处理 清洁级雄性SD大鼠30只,由河北医科大学实验动物中心提供(合格证号:712024),体重 200-250g。将大鼠随机分为3组:正常对照组、糖尿病模型组和丝胶预处理组,每组均为10只。采用2%STZ(25mg/ kg,3d)连续腹腔注射建立糖尿病动物模型,一周后以血糖≥16.7mmol/L作为成模标准;丝胶预处理组大鼠在注射STZ前给予丝胶(2.4g/kg/d)灌胃35d。

2.2 血液指标的检测 各组大鼠用药结束后禁食12h以上,4%水合氯醛腹腔注射麻醉,经内眦采血,3000r/min离心20min,收集血清;采用葡萄糖氧化酶法检测血糖,采用 ELISA方法检测睾酮和IGF-1水平。

2.3 睾丸IGF-1表达的检测 大鼠取血后断头处死,迅速取出双侧睾丸,一侧睾丸入Bouins液固定,另一侧睾丸入液氮速冻保存。

2.3.1 免疫组织化学染色及定量分析:入Bouins液固定睾丸,常规石蜡包埋,Leica石蜡切片机连续切片,片厚5μm。免疫组化染色观察睾丸IGF-1蛋白(一抗1:50)的表达,DAB显色,苏木素复染,常规脱水、透明、封片。阴性对照以PBS代替一抗。以细胞核和/或细胞浆出现棕黄色颗粒或棕褐色颗粒为阳性反应。定量分析:每组选取5只大鼠的睾丸,每个标本选取3张切片,每张切片在10×40倍显微镜下,随机选取组织结构保存较好的精曲小管,应用MiVnt图像分析系统进行定量分析,以免疫阳性产物面积占视野面积的比值作为IGF-1蛋白的相对表达水平,取平均值。

2.3.2 RT-PCR法检测睾丸 IGF-1 mRNA的表达:取100mg睾丸组织,在液氮中碾磨成粉末,按Trizol总RNA抽提说明书操作,提取睾丸组织的总 RNA。取 3μg总 RNA为模板逆转录成cDNA,反 应 条 件 为:30℃,10min;55℃, 30min;99℃,5min;5℃,5min。PCR反应条件:94℃,2min;94℃,30s;50℃-65℃,30s;72℃,1min,第二步起循环。PCR引物序列及扩增条件见表1。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳(含0.5mg/LGoldview),采用ZF型紫外透射反射分析仪摄像,并用 Quantity One-4.6.2软件进行定量分析,以目的条带的光密度与β-actin条带光密度的比值,作为IGF-1 mRNA的相对表达水平。

表1 PCR引物序列及扩增条件Table 1 Primers and amplification condition of PCR

2.4 统计分析

结 果

1.大鼠血糖 结果见表2。糖尿病模型大鼠血糖明显高于正常大鼠(P<0.01);丝胶预处理可明显抑制糖尿病大鼠血糖水平的升高,丝胶预处理组大鼠血糖明显低于模型大鼠(P<0.01)。

2.大鼠血清睾酮和IGF-1水平 结果见表2。糖尿病模型大鼠血清睾酮和IGF-1水平明显低于正常大鼠(P<0.01);丝胶可明显抑制糖尿病模型大鼠血清睾酮和IGF-1水平的下降:丝胶预处理组大鼠血清睾酮和IGF-1水平明显高于糖尿病模型大鼠(P<0.01)。

表2 大鼠血清睾酮和IGF-1水平(±s)Table 2 Testosterone and IGF-1 level in serum of rats(±s)

表2 大鼠血清睾酮和IGF-1水平(±s)Table 2 Testosterone and IGF-1 level in serum of rats(±s)

vsdiabetes model group,＊P<0.01

?

3.大鼠睾丸IGF-1蛋白的表达 各组大鼠睾丸切片均可见IGF-1蛋白免疫阳性染色。IGF-1蛋白免疫阳性产物为棕黄色颗粒状和棕褐色颗粒状,位于间质细胞和支持细胞胞浆,及初级精母细胞胞核(图1)。IGF-1蛋白定量分析结果见表3:与正常对照组大鼠比较,糖尿病模型组大鼠睾丸IGF-1蛋白的表达明显降低(P<0.01);丝胶预处理组大鼠睾丸IGF-1蛋白的表达明显高于糖尿病模型组大鼠(P<0.01)。

4.大鼠睾丸IGF-1 mRNA的表达 RT-PCR结果显示,在280 bp处可见清晰的IGF-1 mRNA条带(图2);在445bp处可见清晰的β-actin mRNA条带(图3)。IGF-1 mRNA定量分析结果见表3:与正常对照组大鼠比较,糖尿病模型组大鼠睾丸IGF-1 mRNA的表达明显降低(P<0.01);丝胶预处理组大鼠睾丸IGF-1 mRNA的表达明显高于糖尿病模型组大鼠(P<0.01)。

图1 睾丸IGF-1蛋白的表达(×200).A:正常组,B:模型组,C:丝胶预处理组Fig.1 IGF-1 protein expression in testes(×200).A:Normal control group,B:Diabetes model group,C:Sericine pretreatment group.

表3 各组大鼠睾丸IGF-1的表达(±s)Table 3 IGF-1 expression in testes of rats in each group(±s)

表3 各组大鼠睾丸IGF-1的表达(±s)Table 3 IGF-1 expression in testes of rats in each group(±s)

vsdiabetes model group,＊P<0.01

Group IGF-1proteinIGF-1mRNANormal control group 0.1069±0.0117＊0.8519±0.1473＊Diabetes model group 0.0357±0.1262 0.3595±0.0771 Sericine pretreatment group 0.0928±0.0091＊0.7088±0.0734＊

讨 论

循环中的IGF-1主要来源于肝脏,其合成受生长激素、胰岛素和营养状况等的调节[5]。研究表明,1型和2型糖尿病患者,普遍存在IGF-1水平的降低,原因是长期高血糖引起肝脏生长激素抵抗,使生长激素促进IGF-1合成的作用丧失;高血糖及胰岛素缺乏本身也可直接抑制IGF-1的合成;糖尿病时三大物质代谢紊乱及糖尿病患者长期饮食控制,潜在营养不良,使IGF-1的清除与降解水平增加[6]。

睾丸内支持细胞、间质细胞及初级精母细胞均有IGF-1表达,且睾丸间质细胞及其它睾丸组织存在IGF-1受体。在睾丸内IGF-1以自分泌和/或旁分泌的方式发挥作用,影响生殖功能:IGF-1作为睾丸间质细胞前体细胞的促有丝分裂因子,通过增加类固醇激素合成酶的表达和调控睾酮的生物合成,调节间质细胞的生长发育,促进雄性激素分泌[7];IGF-1对青春期前的支持细胞有增殖作用,并可维持初级精母细胞DNA的合成,有研究认为IGF-1调节支持细胞功能的作用是通过PI3K/PKB通路实现的[8];另外,IGF-1还可以促进精子获能和顶体反应,提高精子活力和促进精子发生[9]。

本研究发现,糖尿病模型大鼠睾丸IGF-1的表达明显降低,引起睾酮分泌水平下降、生精能力减弱及精子活动能力下降,糖尿病大鼠出现明显的生殖功能减退。目前,糖尿病生殖障碍的发病率是其它人群的5-10倍,给患者的身心健康带来严重的伤害和困扰,随着糖尿病发病率的升高及发病年龄的降低,糖尿病并发的生殖损伤越来越受到社会的极大关注,因此探寻防治糖尿病生殖功能障碍的药物显得尤为重要。丝胶是彩色蚕茧经浸泡、水煎、过滤、浓缩而成,为蚕茧中溶于水的高分子蛋白质,具有多种生物活性,民间有蚕茧泡水降血糖的验方。本课题组的前期研究发现,丝胶可有效降低血糖及提高糖尿病模型大鼠睾丸生精细胞的增殖能力[10-11]。本研究进一步发现,丝胶预处理可明显抑制糖尿病大鼠血清睾酮、IGF-1水平的下降及睾丸IGF-1表达的降低;表明丝胶预处理可通过抑制睾丸IGF-1表达的下调,防止糖尿病时睾酮分泌水平下降、生精能力减弱及精子活动能力降低,因此丝胶预处理可较好防止糖尿病生殖功能损伤的发生。目前,临床上多用西药控制血糖,而丝胶是天然的蛋白质,可避免化学合成药物所产生的毒副作用;但丝胶预处理防止睾丸损伤的机制,是由于降低血糖的继发作用、还是丝胶的直接作用,有待于进一步的深入探讨。

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EFFECTS OF SERICINE PRETREATMENT ON IGF-1 EXPRESSION IN TESTES OF DIABETES MELLITUS RAT MODEL

Fu Wenliang,Zhong Meirong,He Yaqiang,Song Chengjun,Chen Zhihong＊
(Department of A natomy,Chengde Medical College,Hebei067000,China)

Objective To study the effects of sericine pretreatment on the expression of insulin-like growth factor-1(IGF-1)in testes of type 2 diabetes mellitus rat model.Methods 30 male SD rats were randomly divided into 3 groups(n=10):normal control group,diabetes model group and sericine pretreatment group.The type 2 diabetes model was induced by continuous intraperitoneal injection of streptozotocin,and blood glucose≥16.7mmol/Lwas taken as standard.The rats in sericine pretreatment group were lavaged with sericine(2.4g/kg/d)for 35 days before injecting streptozotocin.Glucose oxidase method was used to detect blood glucose of rats in each group,ELISA was used to detect testosterone and IGF-1 level in the serum,immunohistochemical staining and RT-PCR were respectively used to detect the expression of IGF-1 protein and mRNA in testes.Results Sericine pretreatment significantly inhibited increasing of blood glucose,decreasing of testosterone and of IGF-1 level in the serum,and inhibited descending of IGF-1 expression in testes(sericine pretreatment group compared with model group:P<0.01).Conclusion Sericine pretreatment has preventive effects on reproductive dysfunction of diabetic rats,improving the spermatogenic function by preventing the down-regulation of IGF-1 expression in testes.

Sericine;Diabetes;Testis;IGF-1;Pretreatment

R587.1

A

10.3870/zgzzhx.2010.04.010

2010-01-30

2010-04-20

河北省教育厅项目(2006301),河北省科技厅项目(08276101D-19)

付文亮,男(1983年),汉族,硕士研究生。

＊通讯作者(To whom correspondence should be addressed)