幽门螺杆菌L型感染及血管生成素的表达与胃癌血管生成的关系

冯振中 陈嘉薇罗彦丽 王 萍 承泽农

(蚌埠医学院病理学教研室,蚌埠医学院第一附属医院病理科,安徽233030;1上海交通大学附属第一人民医院病理科,上海200080)

幽门螺杆菌L型感染及血管生成素的表达与胃癌血管生成的关系

冯振中 陈嘉薇1＊罗彦丽 王 萍 承泽农

(蚌埠医学院病理学教研室,蚌埠医学院第一附属医院病理科,安徽233030;1上海交通大学附属第一人民医院病理科,上海200080)

目的 探讨幽门螺杆菌L型(Hp-L)感染和血管生成素(Ang)在胃癌中的表达及与肿瘤血管生成的关系。方法 采用革兰染色和免疫组化方法检测84例胃癌和30例癌旁正常组织中 Hp-L型感染,应用免疫组化方法检测Ang-1、Ang-2蛋白表达水平,计数微血管密度(MVD),结合临床病理因素进行分析。结果 胃癌组织中 Hp-L型感染率、Ang-2阳性表达率、MVD值明显高于正常组织(P<0.05),胃癌中Hp-L型感染与肿瘤分化程度、侵袭深度、临床分期、淋巴结转移有关(P<0.05),与Ang-2表达、MVD呈正相关。胃癌组织中Ang-2表达与肿瘤大小、侵袭深度、淋巴结转移有关(P<0.05),与MVD呈正相关。Ang-1在胃癌中表达略低于对照组,但无统计学差异(P>0.05),Ang-1表达与侵袭深度和MVD呈负相关。结论 胃癌 Hp-L型感染在肿瘤血管生成中起重要作用,其机制与Ang-2表达上调, Ang-2/Ang-1比例失衡有关。

胃癌;幽门螺杆菌;血管生成素

胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,侵袭、转移是影响患者预后的重要因素,肿瘤性血管生成在其中发挥关键作用。幽门螺杆菌感染与慢性胃炎、胃癌等疾病的发生密切相关[1],已被WHO定为一级致癌物。Hp在不利于其生长繁殖的环境中易发生细胞壁缺陷而形成 Hp-L型(Helicobacter pylori L-form,Hp-L),具有更强的潜伏性和侵袭性[2]。血管生成素(angiopoietin,Ang)是一类新的内皮细胞生长因子,对血管生成具有双向调节作用,体现了机体内精细的调控机制[3]。迄今,Hp-L型及血管生成素在胃癌肿瘤血管生成中的作用尚不明确,本研究旨在探讨 Hp-L型、Ang-1、Ang-2在胃癌中的表达状况,以及与微血管密度(microvessel density,MVD)和临床病理指标的关系,为肿瘤治疗提供科学依据。

材料和方法

1.研究对象

标本取自蚌埠医学院附属医院2004至2006年手术切除并经病理证实的胃癌标本84例,手术前未接受放疗或化疗。其中男性59例,女25例。年龄36-85岁,平均年龄57岁。高分化30例,中度分化32例,低分化 22例。根据国际抗癌联盟(UICC)和美国抗癌联合会(AJCC)的 TNM分期标准:Ⅰ-Ⅱ期38例,Ⅲ-Ⅳ期46例。有淋巴结转移者49例,无转移者35例。随机选取30例距肿瘤5㎝以上且经病理证实为正常胃组织作为对照组。

2.方法和试剂

所有标本以甲醛固定,石蜡包埋常规制片,羊抗人Ang-1、Ang-2多克隆抗体(工作浓度1:75, 1:50)购自美国Santa Cruz公司,鼠抗人CD34单克隆抗体(工作浓度1:100),兔抗人 Hp多克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司。SP试剂盒和DAB显色液购自福州迈新生物技术有限公司。严格按照免疫组化 SP实验步骤进行,以PBS代替一抗为阴性对照,已知阳性切片作为阳性对照。革兰染色按常规染色进行。

3.结果判断

Hp-L型感染的判断标准[4]:革兰染色和免疫组化染色两者均阳性者视为 Hp-L型感染阳性。革兰染色:油镜(10×100)观察并计数,每例随机观察10个视野取平均数,Hp-L型平均数≥20为阳性,<20为阴性。Hp-L型多为圆球体,革兰染色大多呈红色,少数为紫红色。Hp呈螺旋形、海鸥形等形态,革兰染色红色。免疫组化染色:以肿瘤细胞、胃黏膜上皮细胞的胞质或胞膜出现棕黄色细颗粒为Hp-L型阳性,出现棕黄色螺旋形、长杆状、S形等着色为Hp阳性。

Ang-1,2阳性标准:以染色强度和阳性细胞比例评定阳性表达,细胞胞质或胞膜出现定位明确、染色明显的棕黄/棕褐色颗粒为阳性细胞,所占比例≥10%为阳性病例。MVD判定标准,低倍镜(×40)下选血管密集区,以高倍镜(×200)下计算3个视野中血管数,取均值为微血管密度。以棕黄染的分界清楚的单个内皮细胞或细胞团作为计数单位,不管成腔与否均视为新生的血管。具有较厚肌层的脉管除外。

4.统计学处理

结 果

1.胃癌中 Hp-L型感染、Ang-1、Ang-2和MVD的表达

84例胃癌中Hp-L型革兰染色阳性61例(图1),免疫组化染色阳性65例(图2),两者同时阳性者57例(67.9%),明显高于癌旁正常组织的23.3%(P<0.01)。胃癌中Ang-1蛋白表达阳性率为40.5%,略低于对照组,但差异无统计学意义(P>0.05)。Ang-2阳性率为53.8%,明显高于正常组织(P<0.01),阳性产物定位于癌细胞和胃粘膜细胞的胞质,部分见于血管内皮细胞胞质,呈棕黄色颗粒状(图3)。胃癌组织中MVD值明显高于正常组织(P<0.01),新生肿瘤血管分布于肿瘤间质和周边,壁薄,多为单层,大小不一,形态不规则(图4)。

2.胃癌中Hp-L型感染和Ang-1、Ang-2的表达与临床病理指标的关系

经统计学分析,Hp-L型感染与肿瘤分化程度、侵袭深度、临床分期、淋巴结转移相关(P<0.05),Ang-2表达与肿瘤大小、侵袭深度、淋巴结转移有明显关系(P<0.05),Ang-1蛋白随着肿瘤侵袭深度的增加而表达降低(P<0.05)。上述指标与患者年龄、性别、部位、组织学类型均无明显关联性(P>0.05,表1未列出)。

表1 Hp-L型感染、Ang-1和Ang-2表达与胃癌临床病理指标的关系Table 1 Correlation between Hp L-form infection,expression of Angs and clinicopathological features in gastric carcinoma

3.胃癌中Hp-L型感染、Ang-1、Ang-2的表达和MVD的相互关系

Hp-L型感染组和Ang-2阳性组MVD分别为32.60±6.63、34.59±5.88,明显高于阴性组21.96±4.39、22.93±4.23,两者表达与MVD呈正相关(r=0.671,P<0.01,r=0.802,P<0.01)。Ang-1阳性组MVD值(25.44±7.27)明显低于阴性组(31.72±7.14),两者呈负相关(r =0.401,P<0.01)。Spearman等级相关分析表明Hp-L型感染和Ang-2表达呈正相关关系(r= 0.330,P=0.002)。

讨 论

Hp是世界上最常见的细菌感染之一,并已研究证明是慢性胃炎、胃溃疡、胃癌等病变的确切致病因子,Hp-L型是细菌对不良环境耐受适应的一种形式[5],具有更大的潜伏性和危险性。本研究结果显示,胃癌中Hp-L感染率高于正常组织,并与肿瘤分化、侵袭深度、临床分期和淋巴结转移有关,说明Hp-L感染在胃癌的发生、发展中起着重要作用。可能机制包括:①Hp-L型与 Hp在生物学性状和细胞蛋白方面具有高度一致性[6],Hp-L型可通过Hp的重要致病成分对胃黏膜上皮产生反复损伤,诱导细胞突变;②Hp-L型球形小体的体积与病毒大小近似[7],本实验观察发现,Hp-L型可以黏附在癌细胞表面并定位于细胞胞质内,提示Hp-L型具有病毒类似的致病性,能够整合到宿主体细胞中,引起细胞突变而致癌。

血管生成素是近年来发现的唯一既含受体激动剂又含受体拮抗剂的促血管生成家族,其中Ang-1可促进血管成熟并稳定血管结构,Ang-2是Ang-1的生理拮抗剂,过度表达时抑制血管稳定作用,促进血管出芽、生长。研究发现在多种恶性肿瘤中均可出现Ang-2的过表达,并与肿瘤的恶性生物学行为有关。Mitsuhashi等[8]报道,肝癌中 Ang-2的表达明显高于正常肝组织,Ang-2/Ang-1的比值与肿瘤直径、肝癌门静脉侵犯和MVD呈正相关,比值升高,患者预后不良。这与本研究的结果相似,Ang-1和Ang-2在胃癌和正常组织分布明显不平衡,在肿瘤中Ang-2高表达,Ang-1相对低表达,在正常组织中表达则相反。

本实验结果还提示胃癌Hp-L型感染和Ang-2表达及MVD具有正相关关系,说明Hp-L型感染可诱导 Ang-2蛋白高表达,促进胃癌血管生成,可能因素包括:①细胞因子:Hp-L型感染长期损伤胃黏膜组织,可引起严重的炎症反应,刺激机体产生细胞因子和炎症介质,进一步诱导Ang-2等血管生成因子释放,促进血管生成;②缺氧:Hp-L型感染导致炎性渗出液大量聚集,同时肿瘤细胞增殖较快,导致局部血供不足,缺氧诱导因子大量产生,增强其下游靶基因Ang-2表达,促进血管生成,而新生的肿瘤血管发育不成熟,通透性高,更易于肿瘤细胞浸润和转移。

总之,本研究显示在胃癌组织中 Hp-L型感染、Ang-2和Ang-1的表达不平衡在肿瘤血管生成中具有重要作用。抗 Hp-L型治疗或以Ang-2、Ang-1为靶基因,抑制新生血管的生成,具有潜在的临床应用价值。

[1]Rocco A,Nardone G.H pylori infection and gastric cancer:Evidence and controversies.World J Gastroenterol,2007,13(21):2901-2912

[2]Brenciaglia NI,Fornara AN,Scaltrito NN,et al.Helicobacter pylori:cultivability and antibiotic susceptibility of coccoid forms.Int J Antimicrob Agents,2000,13(4): 237-241

[3]Shi W,Ho I,Wong P,et al.Angiopoietin:A TIE(d) Balance in TumorAngiogenesis.MolCancerRes, 2007,5(7):655-665

[4]于东红,承泽农,贾继辉,等.食管癌幽门螺杆菌L型感染与其血管形成的关系.中华肿瘤杂志,2003,25(1):51-54

[5]Wen M,Zhang Y,Yamada N,et al.An evaluative system for the response of antibacterial therapy:based on the morphological change ofHelicobacter pylori and mucosal inflammation.Pathol Int,1999,49(4):332-337

[6]Dirk B,Hajar H,Biao K,et al.Lack of stage-specific proteins in coccoid helicobacter pylori cells.Infection.Immunity,2004,72(11):6738-6742

[7]Jungblut PR,Bumann D,Haas G,et al.Comparative proteome analysis of Helicobacter pylori.Mol.Microbiol,2000,36(3):710-725

[8]Mitsuhashi N,Shimizu H,Ohtsuka M,et al.Angiopoietins and Tie-2 expression in angiogenesis and proliferation of human hepatocellular carcinoma.Hepatology, 2003,37(5):1105-1113

图 版 说 明

图1 胃癌中Hp-L型感染(革兰染色×1000)。

图2 胃癌中 Hp-L型免疫组化染色阳性表达(SP法 × 400)。

图3 胃癌中 Ang-2阳性表达,定位于胞质(SP法 × 400)。

图4 胃癌中CD34染色的微血管的表达(SP法 ×200)。

EXPLANATION OF FIGURES

Fig.1 Positive expression ofHp-Lin gastric carcinoma(Gram staining×1000).

Fig.2 Positive expression of Hp-Lby immunohistochemistry staining in gastric carcinoma(SP method×400).

Fig.3 Positive expression of angiopoietin-2 protein is located in cytoplasm(SP method×400).

Fig.4 Positive expression of CD34 in gastric carcinoma(SP method×200).

THE RELATIONSHIP BETWEEN HELICOBACTER PYLORI L-FORM INFECTION, ANGIOPOIETIN EXPRESSION AND ANGIOGENESIS OF GASTRIC CANCER

Feng Zhenzhong,Chen Jiawei1＊,Luo Yanli,Wang Ping,Cheng Zenong
(Department ofPathology,Bengbu Medical College,A nhui233030;1Department of Pathology,The First People′s Hospital,S hanghai J iaotong University,S hanghai200080,China)

Objective To investigate the expressions of Hp-Linfection and angiopoietins and their relationship with angiogenesis in gastric carcinoma.Methods Hp-Lwas detected in 84 cases of primary gastric cancer and 30 adjacent normal tissues by Gram staining and immunohistochemistry.The expressions of Ang-1,Ang-2 and CD34 were examined by immunohistochemistry.Results There were significant differences between Hp-Linfection,Ang-2 expression and MVD in gastric cancer and in adjacent normal tissue(P<0.05),but Ang-1 expression had no statistical difference(P>0.05).The expression of Ang-2 and MVD in the Hp-Linfection group were remarkable higher than those in the Hp-Lnegative group(P <0.05),with positive correlations between Hp-Land Ang-2 expression and MVD in tumors.The expression of Ang-2 was related with tumor size,depth of invasion and lymph node metastasis(P<0.05),with a positive correlation with MVD.There was a negative correlation between Ang-1 and MVD in tumors(P <0.05).Conclusion Hp-Linfection may play an important role in angiogenesis of gastric cancer via increasing Ang-2 protein dominant expression against Ang-1 protein.

Gastric carcinoma;Helicobacter pylori;Angiopoietin

R735.2

A

10.3870/zgzzhx.2010.04.007

2010-01-23

2010-04-25

冯振中,男(1975年),汉族,硕士,讲师。

＊通讯作者(To whom correspondence should be addressed)