FISH检测快速诊断曲霉菌感染的临床价值

孟 浦肖 晶潘 峰聂 秀周东风何世斌李立家

(1华中科技大学同济医学院附属协和医院儿科,武汉430022;2武汉大学生命科学学院,武汉430072)

FISH检测快速诊断曲霉菌感染的临床价值

孟 浦1肖 晶1潘 峰1聂 秀1周东风1何世斌2李立家2

(1华中科技大学同济医学院附属协和医院儿科,武汉430022;2武汉大学生命科学学院,武汉430072)

目的 探讨荧光原位杂交技术(FISH)检测曲霉菌感染的可行性和特异性,以期早期病原学诊断临床真菌感染。方法 采用地高辛末端标记的18S-1寡核苷酸探针与27例经HE及PAS染色诊断为可疑真菌感染的石蜡包埋组织切片进行FISH检测。结果 HE及PAS染色可疑真菌感染分别为23例和27例。27例可疑真菌感染标本14例检出FISH阳性信号。结论 FISH可以特异性地检测出组织石蜡切片中的曲霉菌,设计不同菌属探针进行靶DNA杂交可以快速检测各种临床标本中的真菌感染,从而作为IFI早期病原学诊断的一种新策略。

曲霉菌;荧光原位杂交;寡核苷酸探针;侵袭性真菌感染;早期诊断

侵袭性真菌感染(invasive fungal infections, IFI)是指侵袭深部组织的真菌感染和真菌血症,包括霉菌和酵母菌感染[1]。近年来,随着侵入性诊疗手段的运用,免疫抑制剂和广谱抗生素的使用,以及各种大型手术的广泛开展,深部真菌感染尤其是曲霉菌感染的发生率呈上升趋势。IFI临床表现缺乏特异性,早期诊断困难,死亡率高达15%[2]。因此早期病原学诊断以期达到抢先治疗(pre-emptive therapy)及靶向治疗对患者的预后至关重要。近年来,分子生物学检测已成为IFI早期诊断的研究热点之一。

荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)是一种非放射性分子细胞遗传技术,根据不同病原菌的DNA序列特点,设计出种属特异性的探针,用荧光染料标记,可以检测病原菌并快速鉴定菌种。作为分子病理学诊断方法,FISH已应用于检测并区分病理切片中的多种微生物。本研究选择针对曲霉菌属18S rRNA的寡核苷酸通用探针18S-1[3],利用FISH技术检测临床拟诊真菌感染的组织标本,初步探讨了其在临床早期诊断中的可行性和特异性。

材料和方法

1.样本制备

实验组为我院2007年10月-2010年2月27例皮肤科、耳鼻喉科、血液科及肿瘤科等科室活检术后经福尔马林固定、石蜡包埋的病理科存档标本。所选标本病理表现为:水肿,黄褐色沙状物,褐色豆渣样物,息肉样新生物,慢性炎症变化,霉菌块等。全部27例经病理检查均疑诊为真菌感染。阴性对照为12份病理诊断为非真菌感染的组织石蜡标本。每份石蜡标本连续切片3张。阳性对照为标准黑曲霉菌株(F044),由武汉大学生命科学学院赠送,取标准曲霉菌株接种固体察氏培养基30℃培养3d,挑取菌落,制备福尔马林固定、石蜡包埋切片。另设空白对照由实验组和阴性对照各取1张切片。所有石蜡包埋切片二甲苯脱蜡,100-70%系列乙醇水化。

2.探针

参考相关文献[3]制备针对曲霉菌基因组18S rRNA的寡核苷酸探针18S-1。探针由上海生工生物工程技术服务有限公司合成,序列为:5′-GCGGGTCATCATA GAAACACCGC-3′,长度为23个碱基,地高辛末端标记。

3.FISH

参考周东风等[4]原位杂交方法并加以改良:制备后的实验组切片样本经0.2 mol/LHCL室温处理10 min;以蒸馏水冲洗后,蛋白酶 K(10μg/ ml)37℃消化30 min;1×TE buffer冲洗后,置于DNA杂交仪94℃加热5 min,以灭活蛋白酶K;用新鲜卡诺固定液室温固定10 min;1×PBS洗5 min×3次,晾干。每张切片滴加50μl杂交液,含有50%去离子甲酰胺,10%硫酸葡聚糖,20× SSC,100 ng/μl DNA和 50×Denhart’s溶液,覆盖玻片,放入保湿皿中,置于DNA杂交仪95℃变性10 min,立即置于冰上1 min,再放入保湿皿中37℃杂交过夜。洗涤后滴加羊抗地高辛抗体(anti-digoxigenin-FITC,Roche),37℃孵育 45 min;1×PBS室温洗5 min×3次;滴加兔抗羊地高辛偶联物(rabbit anti-sheep-FITC,Roche), 37℃孵育45 min;1×PBS室温洗5 min×3次,晾干。玻片用含抗淬灭剂Vectorshield(Vertor Lab)的DAPI(4′,6-diamidino-2-phenylindole)复染,用Olympus BX60显微镜观察杂交信号,用Photometrics SenSys CCD 1400E照相装置和Metamorph4.6.3(Universal Imaging Crop.)软件俘获图像,Photoshop CS 9.0软件进行图片处理。阳性对照和阴性对照同上述方法行FISH检测。空白对照不加探针进行FISH检测。

4.HE、PAS染色

组织石蜡切片按照本院病理科染色方法进行HE、PAS染色。

结 果

1.HE和PAS染色

27例标本 HE染色诊断可疑真菌感染23例,光镜下HE染色菌丝呈现红色,大部分着色不良,部分组织显示真菌的菌丝体,但无法确定真菌种属。27例标本 PAS染色后诊断可疑真菌感染27例,PAS染色菌丝呈品红色,有些菌丝内见横隔,可见45°分枝,呈珊瑚状排列,部分菌丝较为粗大,形态学上无法鉴别为曲霉或毛霉。

2.FISH

阳性对照结果显示菌丝壁及菌丝内杂交信号呈绿色的颗粒状,杂交信号较强(图A)。27例可疑真菌感染标本14例杂交结果为阳性,组织内信号同阳性对照组,为绿色颗粒状,呈局灶性或散在分布,信号较强,比较容易判断,易与背景区分,可以确定为曲霉菌(图B);13例结果为阴性,未见杂交信号。12例阴性对照和2例不含探针的空白对照均未检出荧光信号(图C、D)。

讨 论

IFI的诊断主要依据临床观察、影像学和实验室检查。其临床表现缺乏特异性,可为发热、呼吸道症状(如咳嗽、咳痰、咯血、呼吸困难等)、组织坏死性损伤或穿孔等,与其他病原菌感染不易区分,且症状易被原发疾病掩盖,早期诊断困难。影像学表现呈多样性,肺部CT少有“光晕征”、“新月形空气征”,实变区域内仅可出现空腔等非特异性征象,其他部位的真菌感染更难以采用CT鉴别,容易误诊。

临床上实验室检查多采用传统的直接镜检和培养法,但仅在无菌体液中检出真菌IFI才具有诊断意义。因此,开放部位的样本需要多次检测并结合临床才能诊断。而培养的周期长,一般为2-3周或更长,阳性率极低,易漏诊,延误治疗。上述方法由于依从性差、周期长,达不到早期诊断、早期治疗的目的。血清学检查主要是抗原检测,包括GM(galactomannan)检测和 BDG(1,3-beta-d-glucan)检测,虽可早期诊断真菌感染,但其结果受阳性界值的影响,国内对其阳性界值的划定尚待研究,又易因患者饮食及使用的药物而产生假阳性或假阴性结果,干扰因素较多,临床尚未推广应用,且无法判断菌种[5]。传统组织病理学检查仅依据形态学观察真菌,若真菌形态不典型则无法鉴别。HE染色的标本中真菌不易着色,PAS染色虽然能够较好的显示真菌形态,如曲霉菌典型表现为菌丝内见横隔,粗细均匀,为45°分枝,呈珊瑚状排列,但多数菌体缺乏特异性,无法区分曲霉与毛霉,不能鉴定曲霉菌的不同菌种,若菌体发生退变坏死,则更难以鉴别。曲霉菌特征性的分生孢子梗在实体的组织病变中很难看到,本研究中的27例病例HE染色诊断可疑真菌感染23例,PAS染色后诊断可疑真菌感染27例,说明仅以形态学诊断或鉴别曲霉菌与其他真菌感染都有较大局限性。

IFI的治疗分为预防治疗、经验治疗、抢先治疗和确诊治疗,近年来国际上越来越重视抢先治疗。近日一项研究表明,对于粒细胞减少的恶性血液病患者,当出现持续发热时,抢先抗真菌治疗能达到与经验治疗相似的生存率,但前者能降低治疗的费用[6]。而抢先治疗的基础就是早期诊断,因此需要新的方法快速检测病原菌,以为临床提供循证学依据。而不同的真菌菌种对抗真菌药物的敏感性不同,因此,甄别IFI的不同菌种对合理选用抗真菌药物有重要意义。

图A.阳性对照显示菌丝壁及菌丝内杂交信号呈绿色颗粒状(×1000);B.实验组阳性结果的杂交信号呈绿色颗粒状(×1000);C、D:阴性对照和空白对照未见荧光信号(×1000)Fig A.The positive control showing green granular hybridzation signal distributed in the hyphae and hyphae walls.(× 1000);B.The positive results of experimental hybridization signal is green granular.(×1000);C、D.Negative control and blank control showing no fluorescence signal.(×1000)

组织病理学检查仅属于形态学诊断,其敏感性和特异性亟待提高,改进措施之一就是结合分子生物学技术,原位杂交技术为检测组织中的真菌提供了快速、敏感的方法。FISH技术能快速检出致病菌,具有高敏感性和特异性。国内外已有报道利用FISH成功检测细菌、真菌等病原菌,其中检测真菌的报道较少,且多选取液体标本如血液、分泌物等。Wilson等[7]用FISH检测244份阳性血培养瓶中的革兰染色阳性念珠菌,Kempf等[8]对115份血液标本进行 FISH,快速检测出白色念珠菌。FISH技术用于检测病原菌具有检测信号强及特异性高等优点。且该技术不同于其他方法之处在于是在完整的细胞内检测菌体,易于避免污染引起的假阳性结果,即使为开放部位的标本也不需要多次检测,而FISH用于检测石蜡切片中的曲霉菌尚无报道。

本研究使用的探针由国外学者设计,是针对曲霉菌 18SrRNA的特异性寡核苷酸探针,以18SrDNA为靶序列。依据文献,该探针序列与烟曲霉、黑曲霉、黄曲霉、土曲霉及灰绿曲霉等有90%-100%的同源性。寡核苷酸探针无需变性,能避免出现双链DNA探针复性的问题,杂交体稳定,杂交速度快,效率高,特异性强,假阳性率少,且制备简便快速,价格低廉。这些特性使得用FISH技术来检测曲霉菌,以排除念珠菌等其他真菌感染具有更突出的优势。本实验将FISH用于临床标本的检测,对27例病理组织石蜡切片进行分析,并与HE及PAS染色结果对比。为识别组织中的阳性杂交信号,试验设置空白对照,即用不含探针的杂交液与组织切片反应,然后用抗体检测。实验组27例标本经FISH检测结果14例为阳性, 13例结果为阴性。阳性对照检出杂交信号强,证明FISH结果具有特异性。阴性对照和空白对照均未见杂交信号,说明探针无非特异性结合。27例标本经 HE和 PAS染色均考虑为真菌感染,HE和PAS染色虽能对大部分真菌显色,但只能从形态学上观察真菌,没有特异性,不能鉴别出是那种真菌感染。而FISH所用的是针对曲霉菌的特异性探针,能敏感的鉴定出曲霉菌。FISH检测不但进一步证实了 HE和PAS染色的真菌为曲霉菌,而且还提示FISH检测13例阴性患者可能为其他真菌种属。

FISH可检测石蜡组织标本中的曲霉菌,在进一步的研究中有望推广于临床,用以检测分泌物、血液及组织切片等各种类型的临床标本,此外,还可根据不同种属的曲霉菌设计出靶DNA序列特异性探针,明确曲霉菌种,以期早期病原学诊断IFI,达到抢先治疗的目的,合理选用抗真菌药物。

[1]Pauw BD,Walsh TJ,Donnelly J P,et al.Revised Definitions of Invasive Fungal Disease from the European Organization for Research and Treatment of Cancer/Invasive Fungal Infections Cooperative Group and the National Institute of Allergy and Infectious Diseases Mycoses Study Group(EORTC/MSG)Consensus Group.Clin Infect Dis,2008,46(12):1813-1821

[2]Menzin J,Meyers JL,Friedman M,et al.Mortality, length of hospitalization,and costs associated with invasive fungal infections in high-risk patients.Am J Health Syst Pharm,2009,66(19):1711-1717

[3]Park C,Kim J,and T.Montone K.Detection of Aspergillus Ribosomal RNA Using Biotinylated Oligonucleotide Probes.Diagn Mol Pathol,1997,6(5):255-260

[4]周东风,刘树茂,费洪宝,等.细胞原位杂交技术在先天愚型诊断上的应用.中华医学遗传学杂志,1996, 13(1):51-52

[5]Barnes RA.Early diagnosis of fungal infection in immunocompromisedpatients.J Antimicrob Chemother, 2008,61(1):i3-i6

[6]Cordonnier C,Pautas C,Maury S,et al.Empirical versus preemptive antifungal therapy for high-risk,febrile, neutropenic patients:a randomized,controlled trial.Clin Infect Dis,2009,48(8):1042-1051

[7]Wilson DA,Joyce MJ,Hall LS,et al.Multicenter evaluation of a Candida albicans peptide nucleic acid fluorescent in situ hybridization probe for characterization of yeast isolates from blood cultures.J Clin Microbiol, 2005,43(6):2909-2912

[8]Kempf VAJ,Trebesius K,Autenrieth IB.Fluorescent In situ hybridization allows rapid identification of microorganisms in blood cultures.J Clin Microbiol,2000, 38(2):830-838

CLINICALV ALUE OF FISH IN THEDETECTIONOF ASPERGILLUS INFECTION FOR RAPID DIAGN OSIS

Meng Pu1＊,Xiao Jing1,Pan Feng1,Nie Xiu1,Zhou Dongfeng1,He Shibin2,Li Lijia2
(1Union Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022;2College of Life Science,Wuhan University,Wuhan 430072,China)

Objective To evaluate the prospect of fluorescence in situ hybridization(FISH)technology in the diagnosis of pediatric invasive fungal infections.Methods 23-base pair oligonucleotides,which were complementary to 18S(18S-1 probes)rRNA of aspergillus and labeled with digoxigenin(DIG)were used as probes.27 formalin-fixed and paraffin-embedded surgical tissue specimens from patients with suspected fungal infection were included in this research.Then these tissue specimens were stained with HE and PAS simultaneously.Results HE and PAS stainings showed suspected fungal infection in 23 cases and 27 cases.FISH for aspergillus rDNA was positive in 14 cases using the 18S-1 probe.Conclusion FISH can detect aspergillus hyphal elements in the formalin-fixed and paraffin-embedded tissue specimens and is a useful method to rapidly and accurately identify aspergillus in tissues.

Aspergillus;Fluorescence in situ hybridization;Oligonucleotide probes;Invasive fungal infections;Early diagnosis

Q781

A

10.3870/zgzzhx.2010.04.003

2010-02-10

2010-04-01

国家自然科学基金(30771204)

孟浦,男(1961年),汉族,副教授

＊通讯作者(To whom correspondence should be addressed)