盐酸伐昔洛韦片的人体药动学及生物等效性研究

赵，洪 博，隋欣蕙，赵春杰（沈阳药科大学药学院，沈阳市110016）

盐酸伐昔洛韦（Valaciclovir hydrochloride）是阿昔洛韦的前体药物，口服后迅速吸收转化为阿昔洛韦。其抗病毒作用为阿昔洛韦所发挥，阿昔洛韦进入疱疹感染细胞之后，与脱氧核苷竞争病毒胸腺嘧啶激酶或细胞激酶，药物被磷酸化成活化型无环鸟苷三磷酸酯，作为病毒复制的底物与脱氧鸟嘌呤三磷酸酯竞争病毒脱氧核糖核酸（DNA）多聚酶，从而抑制了病毒DNA合成，显示抗病毒作用。本品体内的抗病毒活性优于阿昔洛韦，对单纯性疱疹病毒Ⅰ型和Ⅱ型的治疗指数分别比阿昔洛韦高42.91%和30.13%。本研究参考有关盐酸伐昔洛韦制剂的相对生物利用度及其生物等效性评价，采用高效液相色谱法，测定了健康人口服2种盐酸伐昔洛韦片后经时过程的血药浓度，并计算出血药浓度-时间曲线下面积（AUC0～14、AUC0～∞）、相对生物利用度等有关药动学参数，进行生物等效性评价，为临床合理用药及对盐酸伐昔洛韦进一步开发研究提供数据依据及一定的理论基础。

1 材料

1.1 仪器

高效液相色谱仪，包括LC-10AT泵、SPD-10A型紫外检测器（190～600 nm）、SiL-10A全自动进样器（日本岛津公司）；NC-2000型色谱工作站（大连中北科学技术公司）；TGL-16G高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；TG332A型微量分析天平（上海分析天平厂）；AS-3120超声波清洗仪（浙江石浦海天电子仪器厂）；YKH-Ⅱ型液体快速混合器（江西医疗器械厂）。

1.2 试药

阿昔洛韦对照品（成都倍特药业有限公司）；受试制剂：盐酸伐昔洛韦片（成都倍特药业有限公司生产，规格：每片0.3 g）；参比制剂：盐酸伐昔洛韦片（四川明欣药业有限责任公司生产，规格：每片0.3 g）；甲醇为色谱纯，其它试剂均为分析纯，水为三重蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 受试者的选择

18名男性健康志愿者，均为在校大学生，年龄（21～23）岁，体质量（66.2～76.6）kg，身高（171.9～182.1）cm。受试前进行血、尿常规及肝、肾功能等检查，确证为健康者后方可进行试验。试验前2周至试验期间不服用其它任何药物，试验期间禁烟、酒及含咖啡因的饮料，受试者均签署知情同意书，志愿作为受试者参加盐酸伐昔洛韦片的相对生物利用度试验，试验经伦理委员会批准通过。

2.2 试验方案

采用单剂量双周期交叉试验设计。18名志愿者随机分为2组，受试者服药前1天晚上进食清淡，受试当天早晨空腹，服药前定时记录心电图，药物以200 mL温开水送服（顿服），服药后受试者被安排在医院的观察室休息，采血期间不得离开，避免剧烈运动。各种急救药品齐全，设施运转正常，能自始至终保证受试者安全。2组分别于清晨7∶00空腹服用受试制剂与参比制剂2片（各含盐酸伐昔洛韦600 mg），服药后4 h统一进低脂肪标准餐，1周后交叉服药。用药期间和用药后，受试者均未出现任何明显不良反应。受试制剂组与参比制剂组分别于服药前0 h和服药后0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、8.0、11.0、14.0 h时采肘静脉血5.0 mL。所采血样置于含肝素抗凝剂的离心试管中，4 000 r·min－1离心3 min，分离血浆，于－20℃保存待测。

2.3 血浆样品处理

精密吸取血浆样品1.0 mL，置于具塞离心管中，加6%高氯酸0.5 mL，涡旋振荡1.5 min，4 000 r·min－1离心10 min，取上清液，20µL进样分析。

2.4 色谱条件

色谱柱：Kromail C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：0.05 mol·L－1醋酸铵（pH＝4.0）-甲醇（94∶6）；流速：1.0 mL·min－1；检测波长：254 nm；检测器灵敏度：0.01 AUFS；柱温：25 ℃；进样量：20 μL。

2.5 专属性考察

血浆样品按本法分离测定所得色谱图表明，空白血浆中内源性物质无干扰，通过与空白血浆添加对照品色谱图比较，确证9.929 min色谱峰为阿昔洛韦色谱峰。高效液相色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatogram

2.6 标准曲线的制备

取空白血浆1.0 mL，分别加入不同浓度的阿昔洛韦对照溶液 100 μL，使血浆浓度分别为 0.102、0.357、0.510、1.122、4.080、5.100 μg·mL－1，按“2.3”项下方法操作，进样测定，记录色谱。以阿昔洛韦峰面积（A）为纵坐标，阿昔洛韦的浓度（C）为横坐标，按加权最小二乘法（权重1/C2×105）进行回归，得回归方程为：A＝48.24×103C+6.924×103（r＝0.997 0）。结果表明，阿昔洛韦血药浓度在0.102～5.100 μg·mL－1范围内线性关系良好。定量下限为0.102 μg·mL－1。

2.7 回收率及精密度试验

分别配制0.102、1.122、4.080 μg·mL－13种浓度的阿昔洛韦模拟血浆样品5份，按“2.3”项下方法处理后进样测定，记录色谱并计算回收率；另分别于同日内和1周内测定5次，求得日内和日间精密度。精密度及回收率试验结果见表1。

表1 精密度及回收率试验结果（n＝5）Tab 1 Results of precision and recovery test（n＝5）

2.8 稳定性试验

配制1.122 μg·mL－1的模拟血浆样品分别进行长期稳定性、冻融稳定性、室温稳定性试验：（1）长期稳定性试验：血浆样品在－20℃低温冷冻0、7、14、21、30 d后处理分析，测得结果为1.117 μg·mL－1，RSD＝4.79%；（2）冻融稳定性试验：血浆样品在－20℃冷冻24 h，取出完全融解（反复冻融3次），按“2.3”项下方法操作，进样分析，测得结果为1.120 μg·mL－1，RSD＝4.22%；（3）室温稳定性试验：血浆样品在室温条件下放置 0、1、2、4、8 h后处理分析，测得结果为1.106 μg·mL－1，RSD＝5.40%

2.9 药-时曲线

未知血浆样品测定按“2.3”项下方法操作处理，用当天批次的标准曲线计算各时间点样品中阿昔洛韦的血药浓度。18名健康志愿受试者口服2种盐酸伐昔洛韦片600 mg后平均药-时曲线见图2。

图2 受试者口服2种盐酸伐昔洛韦片600 mg后平均药-时曲线Fig 2 Mean plasma concentration-time curve of of the test or reference formulations after oral administration of 600 mg dose

2.10 药动学参数

18名受试者药-时数据分别进行有关药动学参数计算，以梯形法求算AUC，根据对数药-时曲线末端直线部分的斜率求算消除半衰期（t1/2），峰浓度（Cmax）和达峰时间（tmax）用实测值表示。采用交叉设计方差分析法，对受试制剂和参比制剂的主要药动学参数进行方差分析。用双单侧检验法（two one-side test）和（1－2α）置信区间法进行生物等效性评价，主要药动学参数见表2。

表2 受试者口服2种盐酸伐昔洛韦片600 mg后平均药动学参数Tab 2 Pharmacokinetic parameters of the test or reference formulations after oral administration of 600 mg dose

2.11 生物等效性评价

采用交叉设计方差分析法对2种制剂的主要药动学参数进行分析，结果表明2种制剂的Cmax、tmax、AUC0～14、AUC0～∞剂型间、个体间和周期间均无显著性差异，与文献报道[1，2]的盐酸伐昔洛韦片的药动学参数一致。双单侧检验法（two one-side test）和（1－2α）置信区间法计算结果表明，2种制剂的单剂量交叉口服给药的Cmax、tmax、AUC0～14、AUC0～∞的t1、t2值均大于t（1－0.05），且受试制剂参数AUC0～14、AUC0～∞的90%可信限落在参比制剂80%～125%范围内，Cmax落在70%～143%范围内。受试制剂相对于参比制剂的生物利用度为（101.06±11.72）%。因此，2种制剂具有生物等效性。

3 讨论

曾有文献报道采用高效液相色谱荧光法[3]、液-质联用法[4]、高效毛细管电泳法等[5]测定阿昔洛韦的含量，但是上述方法对试验仪器要求较高，不便于推广。本文建立了一种实用范围更广的高效液相色谱-紫外检测法，方法简单，结果准确、可靠。

样品预处理中，综合文献[6]方法考虑，Kishino等[7]采用固相萃取的处理方法，操作过于烦琐，且试验成本较高；Bahrami等[8]采用液-液萃取的方法，依然很复杂。因阿昔洛韦的水溶性较差，较偏碱性，所以本试验采用高氯酸法去蛋白，既可有效去除内源性物质的干扰，又可将阿昔洛韦更完全地提取出来，方法简便、快捷，符合大批量生物样品的分析要求。

流动相考察中，笔者最终选择加入0.05 mol·L－1醋酸铵后调pH值约为4.0时，基线平稳，能将阿昔洛韦峰和其它干扰峰完全分开，且峰形较好。

[1]董亚琳，王茂义，尤海生，等.盐酸伐昔洛韦片的药动学及相对生物利用度[J].中国医院药学杂志，2007，27（9）：1 214.

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[3]施孝金，张莉莉，李 东，等.盐酸万乃洛韦人血浆浓度的HPLC-荧光法测定及其药动学[J].中国医药工业杂志，2002，33（3）：128.

[4]卞晓洁，勉强辉，丁 黎，等.人血浆中阿昔洛韦的HPLCMS法的建立及盐酸伐昔洛韦片的生物等效性研究[J].药学与临床研究，2005，15（1）：28.

[5]梁改玲，连 莹.高效毛细管电泳法测定盐酸伐昔洛韦含量及有关物质[J].药物分析杂志，2007，27（4）：599.

[6]张 洁，李铜铃，孙 建，等.盐酸伐昔洛韦泡腾片在人体内的生物等效性[J].华西药学杂志，2006，21（6）：544.

[7]Kishino S，Takekuma Y，Sugawara M，et al.Liquid chromatographic method for the determination of ganc iclovir and/or acyclovir in human plasma using pulsed amperometric detection[J].J Chromatogr B Analyt Technol Bionmed Life Sci，2002，780（2）：289.

[8]Bahrami G，Mirzaeei1 S，Kiani A.Determination of acyclovir in human serum by high-performance liquid chromatography using liquid-liquid extraction and its application in pharmacokinetic studies[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2005，816（1）：327.