参附汤超微粉单次及多次给药在大鼠体内的组织分布研究

郑爱华 蔡光先 刘红梅

1 实验材料

1.1 药品和试剂 一等人参、附子药材均从湖南省药材公司购置,由湖南省中药超微工程技术研究中心鉴定符合《中国药典》2005版“人参、附子”项下规定。并分别加工为传统饮片、3种不同粒径超微粉(超微粉 1粒径 D90为 18.75μm、超微粉 2D90为 37.5μm、超微粉 3 D90为 75μm)。取参附汤传统饮片饮片,用水煎煮 2次,过滤,滤液浓缩至相当生药量为2.14 g/m l;取参附汤超微中药各粒径粉用水煎煮 2次,过滤,滤液浓缩至 1.07 g/ml,另取超微粉 3滤液,浓缩至 2.14 g/ml。参附汤传统饮片推荐成人日用量为 15 g,参附汤超微粉推荐成人日用量为 7.5 g。

1.2 仪器 岛津 LC-10A高效液相色谱仪(配有 SCL-10Avp输液泵,SIL-10ADvp紫外检测器,CTO-10Asvp柱温箱),日本岛津色谱工作站;TGL-16高速台式离心机;HZS-H水浴振荡器。

1.3 动物 SD大鼠,SPF级,由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供,实验动物生产许可证号为SCXK(沪)2003-0002,实验动物合格证号为 0029453。

2 方法

2.1 单次给药后的组织分布 48只 SD大鼠,随机分为参附汤超微粉 3组、参附汤传统饮片组(每组下设A、B、C、D 4个亚组,每亚组 6只),雌雄各半,分别以 10.7 g/kg、21.4 g/kg灌胃。给药前大鼠禁食过夜直至实验结束,不禁水。各亚组大鼠分别在给药后 1,3,5,7 h股动脉放血处死,取心、肝、脾、肺、肾、脑等脏器,-20℃冷冻保存,分析时,解冻后滤纸吸干水分,称重,按重量体积比(1∶5)加入 HCl1.0mmol/L,匀浆,3000 r/min离心 10min,取上清液置三角瓶中,用饱和 NaHCO3溶液调各个脏器的匀浆上清液 pH值至 8～9,置于冷冻干燥瓶中,进行冷干处理至完全干透。用乙酸乙酯分别提取肝脏(30ml×3)、肾脏(25ml×3)、脾脏(15m l×3)、心脏(20 ml×3)、肺(20ml×3)、脑(20m l×3),合并各组提取液,40℃减压蒸干,将各个脏器样品残渣用甲醇溶解,肝脏 800μl,肾脏 600μl、脾脏 850μl、心脏 900 μl、肺 700μl、脑 500μl、3000 r/m in离心 5min,取上清液 30μl供 HPLC分析[14]。

2.2 多次给药后的组织分布 48只 SD大鼠,随机分为参附汤超微粉 3组、参附汤传统饮片组(每组下设 A、B、C、D四个亚组,每亚组 6只),雌雄各半,分别以 10.7 g/kg、21.4 g/kg剂量灌胃。连续给药90 d,末次给药前大鼠禁食过夜直至试验结束,不禁水。各亚组大鼠分别在给药后 1,3,5,7 h股动脉放血处死,取心、肝、脾、肺、肾、脑等脏器,所取组织及组织样品的处理、分析同“2.1”项。

2.3 色谱条件 色谱柱 MN-Nucleosil7C6H 5不诱钢柱(250 mm×4.0mm);流动相:甲醇:水:氯仿:三乙胺(70:30:1:0.2);流速:1.5 ml/min;检测波长:235nm;检测温度:室温。进样量 20μl。进样前考察研究方法的可靠性和稳定性,建立色谱图、标准曲线,考察其回收率和精密度。

2.4 数据分析 采用中国药理学会的 3P97实用药代动力学计算程序计算处理,获得各项组织分布参数;结果为计量资料,以±s表示,采用 SPSS11.0软件包分析处理;方差齐时,采用方差分析(最小显著差法,LSD),不齐,则采用近似方差分析(Tamhane′s T2)。

3 结果

3.1 大鼠单次与多次给药后的组织分布 单次和多次(90 d)给药后,不同时间点乌头碱在各组织中的分布结果见表1、表 2。结果表明乌头碱在肝脏的浓度最高,其次是肾脏和心脏;重复给药 90 d后,各组织中的乌头碱浓度均有增高。

表1 大鼠单次给参附汤后的组织分布(±s,n=6,μg/g)

表1 大鼠单次给参附汤后的组织分布(±s,n=6,μg/g)

组织 时间点(h)不同时间点乌头碱在组织中的分布心肝脾肺肾脑超微饮片组 1 0.159±0.069 1.695±0.642 0.105±0.037 0.089±0.032 0.389±0.072 0.031±0.005 3 0.120±0.071 1.503±0.547 0.071±0.066 0.076±0.019 0.297±0.067 0.000±0.000 5 0.101±0.064 1.223±0.618 0.052±0.013 0.064±0.009 0.263±0.057 0.000±0.000 7 0.087±0.012 0.809±0.357 0.031±0.007 0.054±0.008 0.172±0.044 0.000±0.000传统饮片组 1 0.162±0.031 1.714±0.702 0.113±0.037 0.091±0.034 0.405±0.037 0.033±0.006 3 0.122±0.035 1.601±0.691 0.074±0.041 0.073±0.015 0.306±0.050 0.000±0.000 5 0.102±0.042 1.263±0.531 0.054±0.009 0.065±0.010 0.274±0.061 0.000±0.000 7 0.082±0.027 0.810±0.079 0.033±0.006 0.059±0.009 0.135±0.030 0.000±0.000

表2 大鼠多次给参附汤后的组织分布(±s,n=6,μg/g)

表2 大鼠多次给参附汤后的组织分布(±s,n=6,μg/g)

组织 时间点(h)不同时间点乌头碱在组织中的分布心肝脾肺肾脑超微饮片组 1 0.203±0.091 3.194±0.837 0.153±0.056 0.147±0.077 0.506±0.075 0.043±0.011 3 0.187±0.053 2.671±0.752 0.131±0.057 0.127±0.038 0.483±0.053 0.030±0.009 5 0.149±0.040 2.127±0.662 0.109±0.062 0.109±0.063 0.361±0.055 0.000±0.000 7 0.116±0.036 1.704±0.530 0.087±0.023 0.083±0.022 0.266±0.074 0.000±0.000传统饮片组 1 0.211±0.038 3.322±0.917 0.160±0.032 0.157±0.042 0.513±0.047 0.037±0.010 3 0.191±0.052 2.816±0.617 0.134±0.073 0.130±0.030 0.497±0.084 0.000±0.000 5 0.135±0.042 2.226±0.597 0.095±0.050 0.102±0.075 0.371±0.057 0.000±0.000 7 0.112±0.057 1.713±0.604 0.076±0.061 0.091±0.017 0.262±0.039 0.000±0.000

4 讨论

参附汤超微粉与参附汤传统饮片经过重复给药 90 d后,在大鼠体内的暴露量均有增加,药物的清除能力均下降,表明参附汤在大鼠体内有蓄积现象。重复给药后的组织分布实验表明各组织中的参附汤浓度均有所升高,且肝、肾、心中药物浓度升高的较多。组织分布试验表明,乌头碱在大鼠各脏器中的分布程度由大到小顺序为:肝、肾、心、脾、肺,其中在肝脏中的分布量占绝对优势,这也进一步说明了乌头碱的体内代谢、排泄主要通过肝脏,其次为肾脏;乌头碱在心、肺中的分布与其较强的抑制呼吸和致心律失常的中毒机理相关。

在脑中检出的乌头碱含量很低,3 h时后未能检出乌头碱,一方面说明检测器的灵敏度不够,另一方面也提示乌头碱的主要作用部位不在中枢神经系统。