龙牡洗剂抗真菌活性试验

张建平 姜烜星 王涛 胡福福

龙牡洗剂主要成分为:龙胆草 15 g、牡丹皮 15 g、白藓皮15 g、蛇床子 15 g,苍耳子 15 g,苦参 15 g,黄柏 15 g、当归 15 g、薏苡仁 15g、薄荷 15 g、地黄 15 g。具有清热燥湿、抗菌消炎、止痛止痒功效,每次用洗剂洗、泡 20m in以上,应用于各种手足癣。本处方的制剂在临床上使用多年,实验论证该制剂的抑菌能力、杀菌作用强弱,从而为中药制剂在临床上的合理应用提供依据。

1 材料及方法

1.1 病原菌检测

1.1.1 配制马铃薯葡萄糖琼脂培养基 取马铃薯块 200～300 g,琼脂 20g,葡萄糖 20 g,水 1000ml。按规程配制,然后分装,灭菌,备用。

1.1.2 刮取患者皮损边缘的鳞屑或水疱壁,进行真菌培养,依形态学特征区分菌属。

1.1.3 培养方法 使用点植法,一点在斜面中央,一点在上1/4处,一点在下 1/4处。培养条件:pH 5.0～7.0,温度 25℃～28℃,分离鉴定真菌,皮肤癣菌在培养基上产生不同色素。

2 药敏试验

2.1 药敏片法

2.1.1 药敏片的制备 取新华 1号定性滤纸,用打孔机打成6mm直径的圆形小纸片。取圆纸片 50片放入清洁干燥的青霉素空瓶中,瓶口以单层牛皮纸包扎。经 15磅 15～20m in高压消毒后,放在 37℃温箱或烘箱中数天,使完全干燥。

2.1.2 抗菌药纸片制作 洗剂制备成 1g:1m l规格备用,在上述含有 50片纸片的青霉素瓶内加入 1 g/ml药液 0.25ml,并翻动纸片,使各纸片充分浸透药液,翻动纸片时不能将纸片捣烂。同时在瓶口上记录药物名称,放 37℃温箱内过夜,干燥后即密盖,置阴暗干燥处存放,有效期 3～6个月。

2.1.3 在超净台中,用经酒精灯灭菌的接种环挑取适量细菌培养物,以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。取药敏片贴到平皿培养基表面[3],每个批号的药物抑菌实验重复 3次,抑菌结果为 3次实验平均值。

2.1.4 质控 标准菌株的抑菌圈直径应落在预期范围内,如果超出该范围,应视为失控而予以纠正。抑菌作用大小主要取决于所用提取物的浓度。

表1 药敏片法实验结果

2.2 比浊法[4]制备 MH(水解酪蛋白)肉汤培养基,分装于试管中,每支 5ml,常压灭菌后加入不同浓度的洗剂,MH肉汤培养基含药浓度分别为 5、2.5、1.25、0.625 g/100 m l。然后接种制备好的实验菌液 0.05m l(105 CFU/ml),并以无药 MH肉汤培养基接种相同菌种作为对照。于 25℃～28℃恒温箱培养 72h后,在 721型分光光度计 480 nm测定各处理液的吸光度,计算细菌的相对生长率。

2.3 平板培养基连续稀释法[4]洗剂用无菌蒸馏水作一系列倍比稀释后,分别将不同浓度药液 2ml加入到 18m l灭菌MH琼脂培养基中制成平板培养基,冷凝后MH平板培养基含药浓度分别 为 5、2.5、1.25、0.625 g/100 m l。 取 0.1 m l(105CFU/ml)实验菌液滴加到MH琼脂培养基表面,用灭菌的L型玻璃棒涂匀。每种浓度药物每个菌种接种 3皿,结果为3次实验平均值,并以无药 MH琼脂培养基接种相同菌种作为对照。置25℃～28℃恒温培养 72 h后,计数各皿菌落数,计算细菌相对生长率。

表2 龙牡洗剂对真菌相对生长率的影响

3 讨论

3.1 实验采用纸片琼脂扩散法、比浊法和稀释法同时进行抗菌实验研究。抑菌圈直径 ＞20mm为极度敏感;抑菌圈直径在 15～20mm为高敏;抑菌圈直径在 10～15mm为中敏;抑菌圈直径 ＜10mm为低敏;无抑菌圈为不敏感(耐药)。龙牡洗剂抑菌圈直径平均为 19.4mm,为高敏。

3.2 从表 2可看出,随着抑菌物浓度的增加,细菌的生长迅速受到抑制,实验结果表明洗剂对真菌均有很强的抑制作用。比较两种培养方式发现,液体培养时,洗剂提取物的抑菌作用较强,细菌生长差,这可能是液体条件下更有利于抑菌物向细菌细胞渗透,易于和细菌细胞膜蛋白质等相互结合,破坏了蛋白质空间结构的完整性,细胞膜的生理功能受到损害,因而生长受到影响。

3.3 用龙牡洗剂外用治疗各类癣病,每次洗、泡二十分钟以上,使药物渗透至皮肤角质层,从而杀灭寄生在皮肤角质层内的癣菌,剂型和用法适合药效的发挥。

[1]马绪荣,苏德模.药品微生物学检验手册.北京:科学出版社,2000:193-210.

[2]郑钧镛,王光宝.药品微生物学及检验技术.北京:人民卫生出版社,1989:347-356.

[3]李明远.微生物学与免疫学.北京:人民卫生出版社,2002:842,126.

[4]周邦靖.常用中药的抗菌作用及其测定方法.重庆:科学技术文献出版社重庆分社,1987:1236.