土牛膝中齐墩果酸、牛膝多糖的提取与鉴定

黄志芳 黄志红 胡吉林 周跃辉 魏得良

土牛膝，别名倒扣草，《中国药典汇编》对土牛膝有如下记载:药性:苦、凉。归肺、脾、肝、膀胱经。药效:败毒抗癌、逐淤除痹，消炎利尿。现代医学研究证明，土牛膝具有改善机体微循环，调整新陈代谢，改善免疫功能等作用。具有明显的抗炎抗菌作用、镇痛作用、抗衰老等［1-3］作用。近年来有研究表明与牛膝含有成分的齐墩果酸、牛膝多糖具有治疗糖尿病的功效［4-6］，但土牛膝提取物在治疗糖尿病方面的研究尚无报道。以本地野生土牛膝为原料经过提取、分离、过滤、干燥得到土牛膝提取物齐墩果酸、牛膝多糖，将对土牛膝提取物治疗糖尿病的研究具有重要意义。

1 材料

1.1 土牛膝 湖南郴州郊外野生自己采集、洗净、除去残留芦头、切段、晒干。

1.2 试剂和仪器 齐墩果酸标准品，优级纯，什邡市巨邦植物原料有限公司;葡萄糖，其余试剂均为市售分析纯。电子天平，上海精密仪器仪表有限公司;低压型抽虑装置，唐山市玻璃仪器厂;722型分光光度计，上海天翔光学仪器有限公司;硅胶板:5～12 cm北京市昌平石鹰化工厂。

2 方法与结果

2.1 土牛膝中齐墩果酸的提取［7］

2.1.1 土牛膝水煮提取液 取土牛膝150 g，制成细块状药材，105℃烘干3 h，取出加10 g碳酸钙细粉和6倍量的蒸馏水，置于1000 ml大烧杯中加热煮沸3次:每次煮沸2 h后过滤得到滤液和滤渣，滤液贮存待用，滤渣用同法煮沸3次，将3次滤液合并，放置5 h后析出沉淀，取上层清液约200 ml。

2.1.2 齐墩果酸的粗提 将上清液置于500 m l烧杯中，加5%Hcl 50 m l混匀，60℃左右水浴加热水解约5 h，水解完毕后溶液有褐色沉淀产生，趁热过滤，水洗滤饼后，滤饼用3%NaOH溶液煮沸后即时过滤得到滤饼，滤饼用水煮沸一次，沸腾后即时过滤，得到钠盐粗品。

2.1.3 齐墩果酸的精制 将粗品加1%活性炭和10倍量的95%乙醇回流热熔1 h趁热过滤，滤液放冷后以稀HCL调PH在1到2之间，放置24 h，使结晶充分，抽滤干后，以蒸馏水洗至近中性，60℃烘干，得齐墩果酸精品1.32 g。

2.1.4 齐墩果酸提取率 提取率=1.32 g/150 g×﹪=0.88%。

2.1.5 齐墩果酸提取品的鉴定［8］性状:呈白色针状结晶与标准品相同。Liebermann-burchard反应:两液面交界处出现红紫色环，为阳性反应。薄层层析及显色:如图1所示，标准品齐墩果酸斑点显紫红色微泛蓝黑色，测定RF值为9.5 cm。供试品在标准品齐墩果酸出现斑点的平行位置处出现斑点，斑点显紫红色微泛蓝黑色，测定RF值为9.4 cm，约为9.5 cm，可以确认供试品的主要成分一样都是齐墩果酸。

2.2 土牛膝中齐墩果酸的含量测定［9］

2.2.1 供试品溶液的制备 精密称取土牛膝的粗粉0.8 g，加50%乙醇-浓硫酸9:1试液20 ml于85℃水浴中回流提取2 h过滤，洗涤，合并滤液，置水浴上挥发去溶剂，残留物用甲醇溶解，置过滤，然后定容10 m l，即得供试品液。

图1 齐墩果酸的薄层色谱图

图2 牛膝多糖水解产物和果糖的TLC图

2.2.2 标准曲线的绘制 精密称取齐墩果酸对照品25.52 mg，置于25 m l量瓶中，用氯仿稀释至刻度。取此对照品溶液10、20、30、40、50 μl于试管中，加 5% 香草醛-冰醋酸溶液 0.20 m l，高氯酸0.8 ml于60℃水浴上加热10 min。取出，立即用冷水冷却，然后加冰醋酸5.00 ml稀释，摇匀后于722型分光光度计550nm波长处测定溶液的吸收度A。由吸收度和相应齐墩果酸对照品量求得回归方程为∶A=0.0072B-0.0068，r=1。

2.2.3 含量测定 精密吸取供试品溶液0.05 ml，用对照品相同的方法测得吸收度A=0.2233，通过计算得齐墩果酸的含量为0.799%。

2.3 土牛膝中牛膝多糖的提取［10］

2.3.1 乙醇回流提取 土牛膝粗粉50 g，用75%乙醇回流提取，回收乙醇，得到药渣，干燥后水提，再浓缩水提液，加95%乙醇充分沉淀，过滤后将沉淀再次水溶解，加入三氯乙酸去除蛋白，取上清液。上清液加95%乙醇沉淀，得到的沉淀物经过抽滤后并经无水乙醇、丙酮、乙醚相继洗涤后低温干燥得牛膝多糖产品3.6 g。牛膝多糖的提取率为:3.6 g/50 g=7.2%。

2.3.2 牛膝多糖提取品的鉴定 性状:呈红褐色粉末状。牛膝多糖水解后会得到葡萄糖和果糖，并且葡萄糖:果糖=1:8。只要鉴定土牛膝多糖的水解产物中含有葡萄糖和果糖，就可证明样品是土牛膝多糖。照薄层色谱法(中国药典2000年版二部附录V B)试验，薄层层析及显色:如图2所示，果糖标准品的薄层色谱图上的主斑点与提取物水解产物的薄层色谱图上的主斑点在相同位置上出现，其RF值相同。斑点的颜色深浅一致，说明该提取物水解产物中含有果糖。做斐林反应有砖红色沉淀产生，说明该提取物水解产物中含有葡萄糖。由此可以证明本实验的提取品是牛膝多糖。

2.4 土牛膝中多糖的含量测定［11］:

2.4.1 供试品溶液的制备 精密称取土牛膝细粉1.000 g。加95%乙醇100 m l，60℃回流提取3 h后过滤醇提药液得到药渣，将药渣干燥 。药渣加水50 ml回流提取2 h，过滤得到滤液，提取3次，合并3次滤液约80 ml用500 ml洁净烧杯贮存。然后浓缩至25 ml，加95%乙醇至含醇量85%，放置24 h使其充分沉淀，抽滤溶液得到残渣，残渣用75%乙醇洗涤，残渣自然干燥，于100 m l容量瓶定容。精密吸取1 ml置50 ml量瓶中定容，即得供试品溶液。

2.4.2 标准曲线的绘制 精密称取葡萄糖0.002 g，置50 m l容量瓶中 ，用水溶解定容，即得葡萄糖对照品溶液45 μg/ml。精密吸取对照品溶液0.0，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 ml于刻度试管中，加蒸馏水至2.0 m l，加5%苯酚溶液1 ml，混匀，迅速加入5 m l浓硫酸，振摇5 min，置沸水浴中15 min，再置冷水浴中冷却30 min，在分光光度计上485 nm处测定吸收度。得回归方程:A=0.01B-0.0608，R=1。

2.4.3 含量测定 精密吸取供试品溶液25 μl，用对照品相同的方法测得吸收度A=0.2605，通过计算得齐墩果酸的含量为12.85%。

3 讨论

本实验采用水煮法提取齐墩果酸提取率为0.88%。分光光度计法测定土牛膝中齐墩果酸的含量为0.799%。提取率比含量略大(0.88% ＞0.799%)，说明提取品齐墩果酸中还是有少量的杂质。用醇提法得到土牛膝多糖的提取率为7.2%，分光光度法测定土牛膝中牛膝多糖的含量为12.85%，提取率比含量略小(7.2% ＜12.85%)，说明提取牛膝多糖不够完全。

［1］史玉芬，郑延彬．牛膝抗炎、抗菌作用的研究．中药通报，1988，13(7):44-47．

［2］陆兔林，毛春芹，张丽．牛膝不同炮制品镇痛抗炎作用研究．中药材，1997，20(10):507-509．

［3］马爱莲，郭焕．怀牛膝抗衰老作用研究．中药材，1998，21(7):360-362．

［4］唐黎明，吕志钧，张小萍，等．牛膝多糖药效学研究．中成药，1996，18(5):31-33

［5］郝志奇，王瑛．齐墩果酸对小鼠的降血糖作用．中国药科大学学报，1991，22(4):210．

［6］李海泉．牛膝多糖降糖作用实验研究．安徽医药，2004，8(5):326-327．

［7］欧艳，徐耀华，等．牛膝中齐墩果酸的提取工艺．中华实用中西医杂志，2003，14(3):65-69．

［8］孟大利，李铣，熊印华，等．中药牛膝中的化学成分的研究．沈阳药科大学学报，2002，19(1):27-30．

［9］汪忠波，敖明章．分光光度法测定竹节参中齐墩果酸皂甙含量．安徽农业科技，2007，35(26):8094-8095．

［10］陈晓明，徐愿坚，田庚元，等．牛膝多糖的理化性质研究及结构确证．药学学报，2005，40(1):32-35．

［11］李根林，杜天信．怀牛膝中多糖含量的测定．中国实验方剂学杂志，2002，1(5):427-430．