HPLC法测定不同产地叶下珠中槲皮素的含量Δ

王琳，朱缨，范淦彬（.苏州卫生职业技术学院，苏州市 5009；.苏州派腾生物医药科技有限公司，苏州市 5009）

HPLC法测定不同产地叶下珠中槲皮素的含量Δ

王琳1＊，朱缨1，范淦彬2（1.苏州卫生职业技术学院，苏州市 215009；2.苏州派腾生物医药科技有限公司，苏州市 215009）

目的：建立以高效液相色谱（HPLC）法测定不同产地叶下珠中槲皮素含量的方法。方法：色谱柱为Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm），流动相为乙腈-0.2%磷酸（30∶70），流速为1 mL·min-1，紫外检测波长为370 nm。结果：槲皮素进样量在0.05～0.40 μg范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系（r＝0.999 9）；平均回收率为102.23%，RSD＝1.87%（n＝6）。云南产的叶下珠中槲皮素的含量最高。结论：本方法简便、快速、准确，可为正确选择叶下珠原料及其综合开发提供科学依据。

叶下珠；槲皮素；高效液相色谱法；含量测定；产地

Δ苏州卫生职业技术学院科技项目课题（Szwzy200713）

＊助教，执业中药师，硕士。研究方向：中药的开发与应用。电话：0512-62690370。E-mail：wanglinlinda@126.com

叶下珠（Phyllanthusurinaria L.）为大戟科叶下珠属植物叶下珠的干燥全草，又名珍珠草、夜合草、阴阳草，全国有33种4个变种，主要分布于长江流域和南方诸省[1]。该药具有清热、解毒、明目等功效，是一种传统的中草药。本课题组通过文献[2，3]和实验研究发现，叶下珠具有明显的抗乙型肝炎病毒（HBV）、保护肝损伤等药理作用，是一种尚未开发利用的很有价值的药用资源，且其抗HBV有效成分之一就为黄酮。目前，对不同产地叶下珠中黄酮含量研究较少，笔者以槲皮素作为叶下珠中黄酮类成分的代表，故采用高效液相色谱（HPLC）法测定广西、云南、江苏、浙江、广东等省的叶下珠中槲皮素的含量。

1 仪器与材料

1.1 仪器

1100型HPLC仪，包括G1311A四元泵、G1315B DAD检测器、G1322在线脱气机、7725i手动进样器、Aglient化学工作站（美国Aglient公司）；CP225D型电子天平（德国Sartorius公司）；乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

1.2 试药

槲皮素对照品（中国药品生物制品检定所，批号：100081-200406）；叶下珠药材由本课题组成员亲自到广西、云南、江苏、浙江、广东等省采集，全部为2008年生产，经苏州卫生职业技术学院朱缨副教授鉴定均为大戟科叶下珠属植物叶下珠P.urinariaL.。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；流动相：乙腈-0.2%磷酸（30∶70）；流速：1 mL·min-1；检测波长：370 nm；柱温：30℃；进样量：20 μL。在上述条件下，叶下珠供试品中槲皮素可达到基线分离，且供试品中其它组分色谱峰无干扰。色谱见图1。

图1 高效液相色谱图A.槲皮素对照品；B.叶下珠供试品；a.槲皮素Fig 1 HPLC chromatogramsA.quercetin control；B.test samples；a.quercetin

2.2 对照品溶液的制备

精密称定干燥至恒重的槲皮素对照品5.0 mg，置100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，制成浓度为0.05 mg·mL-1的槲皮素对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取叶下珠粗粉约15 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇147 mL，再精密加入浓盐酸3 mL，称重，加热回流提取2 h，放冷，再称重，用50%甲醇补足失重，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液5 mL，置10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.4 线性关系考察

分别精密吸取对照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL，置10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为系列对照品溶液。取上述对照品溶液，分别进样20 μL，以槲皮素峰面积积分值（Y）对进样量（X）进行线性回归，得回归方程为Y＝823.78X+1.974（r＝0.999 9）。结果表明，槲皮素进样量在0.05～0.40 μg范围内与峰面积积分值呈良好线性关系。

2.5 精密度试验

取浓度为0.012 mg·mL-1的槲皮素对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，重复进样6次。结果，峰面积平均值为195.2，RSD＝2.14%，表明仪器精密度较好。

2.6 重复性试验

分别取广西产叶下珠药材粗粉6份，分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定。结果，峰面积平均值为106.5，平均含量为0.127 mg·g-1，RSD＝1.2%，表明方法重复性良好。

2.7 稳定性试验

取广西产叶下珠药材制备的供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、10 h测定。结果，峰面积平均值为104.7，RSD＝2.42%，表明供试品溶液在10 h内稳定。

2.8 加样回收率试验

取已知含量（0.127 mg·g-1）的广西产叶下珠药材粉末6份，每份约7.5 g，精密称定，分别加入浓度为0.954 mg·mL-1的槲皮素对照品溶液1 mL，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样20 μL，测定峰面积，计算加样回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果（n＝6）Tab 1Results of recovery test（n＝6）

2.9 样品含量测定

将采于不同产地的叶下珠药材分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液，取供试品溶液与对照品溶液各20 μL，按上述方法测定叶下珠中槲皮素的含量，结果见表2。

3 讨论

3.1 提取条件的选择

表2 叶下珠中槲皮素含量测定结果（n＝5）Tab 2Content determination of quercetin in P.urinaria（n＝5）

本试验曾采用（1）100%甲醇+浓酸、（2）75%甲醇+浓酸、（3）50%甲醇+浓酸回流提取，以及（4）超声波法提取[4]。结果发现，方法（1）和方法（4）中槲皮素提取率低，方法（3）中杂质较多、难分离，只有方法（2）中槲皮素提取率高且易于分离。

3.2 检测波长的选择

曾有人采用254、360[5]、370 nm 3个波长测定槲皮素含量。为了找到最合适的检测波长，笔者采用DAD检测器对槲皮素对照品溶液进行了全波长扫描，发现在波长370 nm处，槲皮素吸收峰的峰形较好、吸收值较大，故选择370 nm作为检测波长，而吸收值最低的285 nm作为参比波长。

3.3 流动相的选择

试验中曾选用甲醇-0.4%磷酸[5，6]、甲醇-乙腈-0.2%磷酸、乙腈-0.2%磷酸溶液作为流动相，结果发现甲醇会使槲皮素形成前延峰，影响检测结果，故选择了最后一种流动相条件。在流动相中加入一定量的磷酸是为了改善峰形和分离度，但为了增加柱的稳定性和使用寿命，应在保证分离度的情况下将磷酸的用量控制在最低。

综上，经试验证实，不同产地叶下珠中槲皮素的含量以云南产最高，且所建方法具有操作简便、快速、准确等优点，可为正确选择叶下珠原料及其综合开发提供科学依据。

[1]吴克芹，吴克霞，李俊婕.抗乙肝植物药叶下珠的研究进展[J].齐鲁药事，2008，27（10）：612.

[2]鲁玉辉，符林春.叶下珠复方在体外细胞培养中抗HBV活性的研究[J].中国热带医学，2007，7（25）：19.

[3]邓学龙，朱宇同，郭兴伯，等.先天和后天感染鸭乙肝病毒的广州麻鸭外周血中病毒血症的动态比较及应用[J].广州中医药大学学报，1999，16（1）：561.

[4]刘榕城，胡 炜，邓光辉，等.超声波法碱水提取叶下珠黄酮的研究[J].时珍国医国药，2008，19（7）：1 599.

[5]周 伟，蔡光明，黄鹤慧，等.高效液相色谱法测定小叶黑柴胡中槲皮素与异鼠李素的含量[J].中国药房，2007，18（9）：693.

[6]臧亚茹，陈四平.RP-HPLC法测定山楂叶提取物中槲皮素的含量[J].中国药房，2008，19（15）：1 163.

Content Determination of Quercetin inPhyllanthus urinariafrom Different Habitats by HPLC

WANG Lin，ZHU Ying（Suzhou Heath College，Suzhou 215009，China）
FAN Gan-bin（Suzhou Patent Biological and Pharmaceutical Technology Co.，Ltd.，Suzhou 215009，China）

OBJECTIVE：To develop a HPLC method for content determine of quercetin inPhyllanthus urinariafrom different habitats.METHODS：The determination was performed on Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）column with acetonitrile-0.2%phosphoric acid（30∶70）as mobile phase at flow rate of 1 mL·min-1.The detection wavelength was set at 370 nm.RESULTS：The linear range of quercetin was 0.05～0.40 μg（r＝0.999 9）with an average recovery of 102.23%（RSD＝1.87%，n＝6）.CONCLUSION：The method is simple，rapid and accurate.It provides scientific basis for the selection of raw material and comprehensive development ofP.urinaria.

Phyllanthus urinaria；Quercetin；HPLC；Content determination；Habitats

R284.1；R927.2

A

1001-0408（2010）39-3717-02

2009-10-02

2009-11-24）