HPLC法测定不同来源甘草中甘草酸的含量Δ

唐丽琴，张善堂，刘 圣，石允卉（安徽医科大学附属省立医院药剂科，合肥市 230001）

HPLC法测定不同来源甘草中甘草酸的含量Δ

唐丽琴＊，张善堂，刘 圣，石允卉（安徽医科大学附属省立医院药剂科，合肥市 230001）

目的：建立以高效液相色谱法测定甘草中有效成分甘草酸含量的方法，并测定不同产地和基原甘草药材中甘草酸的含量。方法：色谱柱为Hypersil-C18（250 mm×4.6 mm，5µm），流动相为甲醇-0.2 mol·L-1醋酸铵溶液-冰醋酸-三乙胺（64∶36∶1.5∶0.02），流速为1.0 mL·min-1，检测波长为252 nm，柱温为30℃。结果：甘草酸检测浓度在0.041 6～0.208 0 mg·mL-1范围内与峰面积积分值呈良好线性关系（r＝0.999 9）；平均回收率为101.3%，RSD＝1.22%（n＝9）。结论：不同来源甘草药材中甘草酸的含量差异较大，野生甘草中甘草酸的含量高于家种。

甘草；甘草酸；高效液相色谱法；含量；来源

Δ安徽省自然科学基金面上项目（090413106）

＊副主任药师，博士。研究方向：临床药学、药理学。电话：0551-2283378-809。E-mail：tulcyl@vip.sina.com

甘草为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.、胀果甘草G.inflateBat.或光果甘草G.gliabraL.的干燥根及根茎，具补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药之功效[1]。甘草酸是其最重要的活性成分之一[2～4]，具有抗炎、抗溃疡、抗肝毒素以及抗癌等药理作用[5，6]。但商品甘草的产地、基原等来源复杂，其有效成分甘草酸的含量也存在很大差异，这给医院临床用药造成一定影响。目前，国内对不同来源甘草饮片有效成分的系统研究较少，为此本研究以甘草酸为检测指标，采用高效液相色谱（HPLC）法对不同产地不同基原的甘草进行初步分析研究，以期为医院的甘草饮片采购提供选择依据，从而为临床提供更佳的药材。

1 仪器与材料

1.1 仪器

LC-6A型HPLC仪，包括SPD-6AV紫外-可见检测器、HS色谱数据工作站（日本岛津公司）；ZG-1型打粉机（上海淀元实业有限公司）；BT124S型电子分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；JK-DY500型医用数控超声清洗器（合肥金尼克机械制造有限公司）。

1.2 试药

甘草酸单铵盐对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110731-200614）；甲醇为色谱纯，冰醋酸、醋酸铵、三乙胺为分析纯，水为重蒸馏水；甘草药材均为从当地购买的市售药材，并经安徽中医学院药学院刘守金教授鉴定为真品。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Hypersil-C18（250 mm×4.6 mm，5µm）；流动相：甲醇-0.2 mol·L-1醋酸铵溶液-冰醋酸-三乙胺（64∶36∶1.5∶0.02）；检测波长：252 nm；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1；进样量：20 μL。理论板数按甘草酸峰计算应不低于2 000。色谱见图1。

图1 高效液相色谱图A.对照品；B.甘草药材；1.甘草酸单铵盐Fig 1 HPLC chromatogramsA.reference substance；B.G.uralensis；1.monoammonium glycyrrhizinate

2.2 对照品溶液的制备

称取甘草酸单铵盐对照品约10 mg，精密称定，置于10 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，制成浓度为1.06 mg·mL-1的甘草酸单铵盐溶液，折合甘草酸为1.04 mg·mL-1，作为对照品贮备液。再精密量取对照品贮备液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL，置于10 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，得到含甘草酸分别为 0.041 6、0.083 2、0.124 8、0.166 4、0.208 0 mg·mL-1的对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取甘草药材粉末约0.2 g，精密称定，置于50 mL容量瓶中，加入流动相适量，超声提取45 min，静置，用流动相定容，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.4 线性关系考察

分别精密吸取“2.2”项下各对照品溶液20 μL，按上述色谱条件进行测定。以峰面积积分值（A）对对照品浓度（C）进行线性回归，得回归方程为A＝9.0×106C＋2 072.7（r＝0.999 9）。结果表明，甘草酸检测浓度在0.041 6～0.208 0 mg·mL-1范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验

精密吸取浓度为0.124 8 mg·mL-1的对照品溶液20 μL，按上述色谱条件连续进样6次，测定峰面积。结果，RSD＝0.52%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

精密量取同一供试品溶液20 μL，分别在0、1、2、3、4、5、24 h进样测定。结果，RSD＝1.07%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.7 重复性试验

称取同一甘草样品粗粉约0.2 g，平行6份，精密称定，按“2.3”项下方法制备供试品溶液。精密吸取20 μL，按上述色谱条件测定并计算甘草酸含量。结果，RSD＝1.11%，表明方法重复性较好。

2.8 加样回收率试验

取已知含量的甘草样品9份，每份约0.1 g，精密称定，加入相应量的对照品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定，计算加样回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果（n＝9）Tab 1Results of recovery test（n＝9）

2.9 最低检测限测定

将对照品溶液稀释测定，测得信噪比为3∶1时，甘草酸的最低检测浓度为0.083 2 μg·mL-1。

2.10 样品含量测定

取10个不同产地和基原的甘草药材各0.2 g，精密称定，分别按“2.3”项下方法制成供试品溶液，按上述方法测定甘草酸含量，结果见表2。

3 讨论

3.1 流动相的选择

对于甘草酸的含量测定，2005年版《中国药典》采用的流动相为甲醇-0.2 mol·L-1醋酸铵-冰乙酸（67∶33∶1）[1]，但预试验却发现甘草酸单铵盐的保留时间太短且峰形不好。经过多次试验，发现以甲醇-0.2 mol·L-1醋酸铵-冰乙酸-三乙胺（64∶36∶1.5∶0.02）为流动相时，样品分离度、对称性及峰形均较好，且保留时间适中，故最终确定本试验的流动相为甲醇-0.2 mol·L-1醋酸铵-冰乙酸-三乙胺（64∶36∶1.5∶0.02）。

表2 10批甘草样品的含量测定结果Tab 2 Content determination of glycyrrhizic acid in 10 batches of samples

3.2 提取溶剂的考察

本研究对提取溶剂（50%甲醇、甲醇、流动相）进行了考察，结果表明用流动相作提取溶剂效率最高，故最终确定用流动相作提取溶剂。

3.3 提取时间的考察

本研究考察了超声提取的时间（20、30、45、60 min），结果表明提取45 min后，提取时间延长并不能显著提高提取效率，故选择提取时间为45 min。

3.4 冷浸时间的考察

本研究考察了冷浸时间（0、10 h）对提取效率的影响，结果表明冷浸对提取效率影响不大，故选择不用冷浸。

3.5 小结

研究显示，不同来源的甘草药材中有效成分甘草酸的含量有较大差异，相差最大的近4倍，其中野生甘草中甘草酸的含量较家种甘草中甘草酸的含量高，编号为8、9、10的3种不同产地的家种乌拉尔甘草的含量低于2%，未达到2005年版《中国药典》的最低标准。可见，不同来源的甘草药材其内在质量存在较大差异，医院在采购药材时应加以注意。

[1]国家药典委员会编.中华人民共和国药典（一部）[S].2005年版.北京：化学工业出版社，2005：59.

[2]慕桂娟.甘草化学成分的研究进展[J].包头医学，2005，29（2）：25.

[3]田庆来，官月平，张 波，等.甘草有效成分的药理作用研究进展[J].天然产物研究与开发，2006，18（5）：343.

[5]潘英伟，陈卫平，奚丽君.甘草减毒作用的应用与机理分析[J].南京中医药大学学报，2008，24（6）：428.

[6]徐淑英，张玉臣.复方甘草酸苷治疗戊型病毒性肝炎疗效观察[J].泰山医学院学报，2008，29（9）：715.

Content Determination of Glycyrrhizic Acid inGlycyrrhiza uralensisfrom Different Sources by HPLC

TANG Li-qin，ZHANG Shan-tang，LIU Sheng，SHI Yun-hui（Dept.of Pharmacy，The Affiliated Anhui Provincial Hospital，Anhui Medical University，Hefei 230001，China）

OBJECTIVE：To establish the HPLC method for the content determination of glycyrrhizic acid inGlycyrrhiza uralensisfrom different sources.METHODS：The separation was performed on Hypersil-C18（250 mm×4.6 mm，5 µm）column with mobile phase consisted of methanol-0.2 mol·L-1ammonium acetate-glacial acetic acid-triethylamine（64 ∶36 ∶1.5 ∶0.02）with the flow rate of 1.0 mL·min-1.The detection wavelength was set at 252 nm and column temperature was 30℃.RESULTS：The linear range of glycyrrhizic acid was 0.041 6～0.208 0 mg·mL-1（r＝0.999 9）with an average recovery of 101.3%（RSD＝1.22%，n＝9）.CONCLUSION：The content of glycyrrhizic acid is variant in different origin and sources.The content of glycyrrhizic acid in wildG.uralensisis higher than that of domestic species.

Glycyrrhiza uralensis；Glycyrrhizic acid；HPLC；Content；Source

R284.1；R927.2

A

1001-0408（2010）39-3700-02

2009-10-10

2009-11-06）