GnRH－A免疫与母兔生殖激素浓度的变化

魏锁成，巩转娣，韦敏，赵兴绪

(1.甘肃农业大学动物医学院，兰州730070;2.西北民族大学生命科学与工程学院，兰州 730030; 3.西北民族大学医学院，兰州 730030)

研究报告

GnRH－A免疫与母兔生殖激素浓度的变化

魏锁成1，2，巩转娣3，韦敏2，赵兴绪1

(1.甘肃农业大学动物医学院，兰州730070;2.西北民族大学生命科学与工程学院，兰州 730030; 3.西北民族大学医学院，兰州 730030)

目的探讨促性腺激素释放激素类似物(GnRH－A)对动物生殖功能调节的效果和作用机制。方法

24只日本大耳白兔分为四组，分别在实验Ⅰ组(EG－I)、实验Ⅱ组(EG－II)和实验III(EG－III)组兔的颈背侧注射1.0 m L(100、100和50 μg/m L)GnRH－A抗原，实验II组和实验III组于第3周以原剂量加强注射一次，用ELISA法测定血清GnRH抗体效价、促卵泡刺激素(FSH)和促黄体生成素(LH)含量。结果注射GnRH－A后10 d实验组兔均出现GnRH抗体，而对照组未检测到;EG－I在第30天达到高峰，而EG－II和EG－III于40～50 d至峰值，但在实验结束时(70 d)实验组均高于对照组，40～70 d时EG－II显著高于EG－I和EG－III。30～50 d时EG－II的LH明显高于EG－I和EG－III及对照组。EG－II和EG－III的FSH浓度在40 d达到峰值，但EG－II高于EG－I、对照组及EG－III，EG－I和对照组无显著差异。结论兔体内注射GnRH－A可以明显提高GnRH抗体效价，增强LH和FSH的合成与分泌，加强注射效果更明显，且与注射剂量相关，持续时间为40 d左右。

促性腺激素释放激素类似物;促卵泡刺激素;促黄体生成素;母兔

促性腺激素释放激素(GnRH)由丘脑下部释放后与垂体前叶的促性腺激素分泌细胞(嗜碱性细胞)细胞膜上的特异受体结合，通过激活腺苷酸环化酶－cAMP－蛋白质酶体系，促进促黄体生成素(LH)和促卵泡刺激素(FSH)的合成与释放，但是，LH和FSH对GnRH的作用有所不同。促性腺激素释放激素类似物(GnRH－A)是在天然的GnRH分子结构上替换了第6、10位上的氨基酸所得，GnRH－A与GnRH具有十分相近的作用，然而，这种结构的改变可减慢肽的降解，延长半衰期，使受体结合力增强100～200倍［1，2］。

Martemucci等［3］和Herman等均报道，GnRH主动免疫引起血浆LH水平急剧降低，而FSH只有轻度降低。有人给大鼠、兔、绵羊等动物快速静脉注射GnRH及GnRH－A时，主要引起血浆LH水平明显升高，但是用相同剂量的GnRH缓慢注射时，不但使LH水平升高，而且FSH水平也明显升高。此外，近年来国内外广泛应用GnRH及GnRH－A来提高家畜繁殖性能，取得了良好的效果，认为GnRH及GnRH－A可诱发母畜排卵、提高受胎率。如配种前给母畜肌肉注射GnRH－A，可诱发母畜排卵，提高受胎率;分娩后早期用GnRH处理可加速牛的发情排卵、子宫复旧、缩短产犊间隔。Phatak等、马玉林等［4］对羊的实验表明，注射一定剂量的GnRH及类似物，能有效的提高其受胎率12%～15%。适量GnRH－A通过下丘脑－垂体－卵巢轴，引起垂体释放LH和FSH［5］。因而，GnRH－A注射后对动物生殖功能与性腺激素的合成及分泌究竟有何作用? GnRH－A的注射剂量多少为宜?GnRH的抗体效价如何变化?作用的维持时间多长?下丘脑及垂体的组织结构是否改变等等问题需进一步深入探讨。为此，我们在前期研究的基础上，对日本大耳白兔的GnRH－A进行了生殖免疫调节实验研究，以期为科学应用GnRH－A调控母畜的生殖机能提供依据，并探讨GnRH－A的作用机制和临床推广价值。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

GnRH－A，Zillion公司生产，纯度(HPLC)≥98.99%;碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCL)，上海延长生化科技发展有限公司生产，纯度(HPLC)≥99.23%;牛血清白蛋白(BSA)和弗氏不完全佐剂，美国Sigma公司生产;二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔血清，博大泰克生产;促卵泡激素检测试剂盒(ELISA)、促黄体激素检测试剂盒(ELISA)，北京北方生物技术研究所提供，96孔板。

1.2 主要仪器

TQ16－W型高速离心机(长沙湘仪)，透析带(Solarbio公司)，96孔酶标板(博大泰克)，Multiskan MK3型酶标仪(Thermo公司)，分析天平等。

1.3 实验动物

3月龄健康日本大耳白兔(Oryctolagus cuniculus)24只，雌性，体质量2.2～2.6 kg，购于兰州生物制品研究所实验动物中心(编号:2006－033)，随机分为4组，实验Ⅰ组(EG－I)、实验II组(EG－II)、实验Ⅲ组(EG－III)和空白对照组(CG)，每组6只。所用兔均分笼饲养，自由饮食。预饲10 d后进行正式实验，按实验动物使用的3R原则给予人道关怀。

1.4 抗原制备

以碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCL)为偶合剂，将GnRH－A与牛血清白蛋白(BSA)连接为复合物，再加入弗氏不完全佐剂制成抗原乳剂。利用紫外吸收法求出GnRH－A的结合率为85%。并按参考文献［6］进行无菌性、安全性和物理性状检验。

1.5 免疫注射方法

在实验Ⅰ组(EG－I)、实验Ⅱ组(EG－II)、实验Ⅲ组(EG－III)每只兔的颈背部皮下注射1.0 mL(100、100和50 μg/m L)GnRH－A抗原。EG－II和EG－III组于3周后分别用相同剂量与方法加强免疫一次。对照组(CG)不做任何处理。免疫注射当天记为d0。

1.6 血样采集

每只兔于注射GnRH－A抗原前1 d、注射后10、20、30、40、50、60和70 d分别从颈静脉采血10 mL，采集的血液立即37℃水浴30 m in，2500～3000 r/ min离心10～12 m in，分离血清，－20℃保存。采血前禁食12 h。

1.7 检测项目

1.7.1 GnRH抗体效价测定:用间接ELISA法测定［7］。

1.7.2 血清FSH和LH浓度测定:用血清促卵泡激素(FSH)诊断试剂盒和血清促黄体激素(LH)诊断试剂盒(ELISA法)测定。具体操作步骤如下:①设空白孔、标准品孔、待测样品孔。每个标准品孔加入标准液50 μL，待测样品孔加血清50 μL。②每孔加FITC标记抗体50 μL，充分混匀，37℃孵育60 m in。空白孔不加任何液体。③弃去液体，每孔加洗涤液，静置10 s，重复3次拍干。④每孔加入酶结合物，充分混匀，37℃孵育30 min。⑤加显色剂A液和B液各50 μL，振荡混匀，37℃避光显色15 m in。⑥每孔加终止溶液50 μL。⑦用酶标仪在450 nm波长测量各孔的吸光度(A值)。

1.8 数据统计学分析

以Spss13.0统计学软件处理数据，用平均值±标准差(±s)表示，t检验进行显著性检验。

2 结果

2.1 抗原包被浓度及血清最佳工作浓度结果

当抗原稀释800倍和血清稀释100倍时，其A490为0.987，最接近1，所以抗原最佳浓度为1∶800倍稀释，血清的最佳浓度为1∶100倍稀释［7］。

2.2 GnRH抗体效价见表1。

表1 血清GnRH抗体效价测定值(±s)Tab.1 Determination of serum GnRH antibody titer in the immunized rabbits(±s)

表1 血清GnRH抗体效价测定值(±s)Tab.1 Determination of serum GnRH antibody titer in the immunized rabbits(±s)

注:同一列中，标肩字母相同表示差异无显著性(P＞0.05);标肩不同表示差异有显著性(P＜0.05)，其中标肩字母相连(如ab，bc等)表示差异有显著性(P＜0.05)，标肩字母间有间隔(如ac，bd等)表示差异有显著性(P＜0.01)。下同。Notes:The same superscript letters in the same column mean that there was no significant difference(P＞0.05).The different superscript letters mean that there was a significant difference between groups，of which ad jacent superscripts(such as ab)indicate that the difference was significant(P＜0.05)，while interval superscripts(such as ac，bd)show that the difference was highly significant(P＜0.01).The same as in the following tables.

组别Group免疫时间(d)Immunization time(d) 0 10 20 30 40 50 60 70 EG－I 0 200 400a800a400c200c100c100 EG－II 0 200 400a800a1600a1600a800a400 EG－III 0 100 200b400b800b800b400b200 Control 0 0 0c0c0d0d0c0

由表1可以得出，EG－I、EG－II和EG－III在注射GnRH－A后10 d均出现GnRH抗体，对照组未检测到GnRH抗体，实验组始终高于对照组;在第10～30天时EG－I和EG－II组抗体效价相同，但显著高于EG－III(P＜0.05)及对照组(P＜0.01);EG－I在第30天达到高峰，而EG－II和EG－III于40～50 d至峰值，然后抗体效价开始下降，但在实验结束时(70 d) 3个实验组仍高于对照组(P＜0.05);40～70 d时EG－II显著高于EG－I和EG－III(P＜0.01)。表明兔体内注射GnRH－A可以明显提高GnRH抗体效价，加强注射效果更明显，其持续时间为40 d左右。

2.3 血清LH浓度测定值见图1。

图1 兔血清LH浓度的变化Fig.1 Changes of serum luteinizing hormone concentration in the female rabbits

由图1得出，EG－I的LH除注射后10 d略升高外，始终保持稳定，这与对照组基本相同;EG－II和EG－III的LH均在注射后40 d至峰值(P＜0.05)，此后降低。30～50 d时EG－II明显高于EG－I和EG－III及对照组，也高于注射前水平。证明加强注射GnRH－A可以增强LH的合成与分泌，而且与注射的剂量相关。

2.4 血清FSH浓度的测定值见表2。

从表2得出，EG－II和EG－III的FSH浓度在注射后30 d开始升高，至40 d达到峰值，EG－II明显高于EG－I和对照组(P＜0.01)及EG－III(P＜0.05)，EG－III也高于EG－I和对照组(P＜0.05);整个实验期间EG－I和对照组差异无显著性。表明加强注射GnRH－A可以增强FSH的合成与分泌，而且注射剂量大作用更明显。

3 讨论

GnRH由丘脑下部合成，并以脉冲方式分泌进入垂体门脉系统，到达垂体前叶发挥诱导促性腺激素释放的作用，调节垂体LH/FSH的合成与释放［8，9］。GnRH与具有免疫原性的大分子蛋白载体偶联后免疫动物，可诱导体内产生特异性抗GnRH的抗体。Adams等［10］用钥孔威血蓝蛋白(keyhole limper hemocyain，KLH)与GnRH偶联对小公牛进行免疫，20周后抗体效价达到最高值，Esbenshade等［11］用GnRH免疫母猪，也发现抗体效价在第15周达到最高。本实验表明GnRH－A注射兔后10d实验组血清中均可检测到GnRH抗体，GnRH抗体在30 d左右达到高峰，其中EG－I、EG－II和EG－III的GnRH效价分别为为1∶800、1∶800和1∶400，EG－II (100 μg/m L加强组)在50 d时仍高达1∶1600，说明GnRH抗体效价有一定的持续时间，且与注射剂量密切相关，这与Bambino的结论相吻合。因此，为了更好的维持抗体高水平，加强免疫是必要。

表2 母兔血清FSH测定值(±s，m IU/m L)Tab.2 The concentration of serum follicle－stimulating hormone in the female rabbits(Unit:m IU/mL)

表2 母兔血清FSH测定值(±s，m IU/m L)Tab.2 The concentration of serum follicle－stimulating hormone in the female rabbits(Unit:m IU/mL)

组别Group免疫时间(d)Immunization time(d) 0 10 20 30 40 50 60 70 EG－I 1.361±0.078 1.425±0.123 1.427±0.202 1.350±0.213a1.338±0.097a1.359±0.186a1.369±0.193 1.362±0.207 EG－II 1.326±0.082 1.421±0.202 1.435±0.289 1.510±0.388b1.710±0.308c1.482±0.209b1.474±0.183 1.454±0.215 EG－III 1.419±0.127 1.425±0.195 1.410±0.301 1.525±0.375b1.626±0.345b1.458±0.231b1.345±0.207 1.314±0.267 Control 1.374±0.205 1.388±0.096 1.386±0.221 1.352±0.264a1.362±0.224a1.350±0.256a1.407±0.242 1.384±0.179

GnRH抗体可特异地中和动物体内的GnRH，从而影响到与GnRH有关的LH和FSH等激素的合成与分泌，使动物正常的生殖性能发生改变。GnRH不但可通过影响垂体LH和FSH的分泌，而且还直接作用于性腺，调节性腺功能。GnRH主要是降低性腺上的LH受体的数量而不改变受体的亲和力。GnRH免疫由于引起垂体促性腺激素尤其是LH水平的下降，将导致性腺、性激素的变化，最终导致生育力的降低甚至丧失［12］。Esbenshade等［11］用GnRH免疫母猪后血清中LH浓度在12周降到不可测的水平，这些研究结果表明GnRH免疫动物后，对内源性LH和FSH的合成与分泌有特异性抑制作用。Clarke等［13］用GnRH免疫公羊和母羊，经检测免疫动物外用血液中LH和FSH水平，与对照组相比明显降低。然而，叶联顺［14］用尿促性腺激素(HMG)加HcG对6～12月龄的新西兰母兔进行超排处理，测定超排前后不同时期血清FSH、LH和P (孕激素)的浓度，结果表明FSH和LH分别在超排后96 h和15 h达高峰水平，证明家兔超排后生殖内分泌激素有显著性变化。由此可见，排卵前后血清生殖激素的浓度是不相同的。本实验证明给兔在第3周强化免疫后LH和FSH水平增加，表现为EG－II的LH在30～50 d明显高于EG－I和EG－III及对照组，也高于注射前水平，而EG－I和对照组无显著差异;FSH浓度的变化与LH基本相同，EG－II和EGIII的FSH浓度在注射后30 d开始升高，至40 d达到峰值，EG－II明显高于EG－I和对照组及EG－III。这是否与本实验中的兔有排卵以及注射GnRH－A的剂量或次数有关尚待深入探讨。

另外，一些体外实验证实，垂体细胞受GnRH刺激时，LH和FSH的最大分泌量和基础分泌量不同，LH的比率比FSH高，因此LH分泌量的变化幅度比FSH的大，本实验也基本证明了这一点［15］。

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GnRH-A Imm unization and the Changes of Reproductive Horm one Concentration in Fem ale Rabbits

WEI Suo－cheng1，2，GONG Zhuan－di3，WEI M in2，ZHAO Xing－xu1
(1.Gansu Agriculture University，Lanzhou 730070;2.Life Science and Engineering College; 3.Medical College，Northwest University for Nationalities，Lanzhou 730030，China)

ObjectiveThe objective of this study was to investigate the efficacy and mechanisms of reproductive function immunological regulation by injecting gonadotropin releasing hormone analogue(GnRH－A)in animals.M ethods

24 female rabbits were divided random ly into four groups，namely experimental group 1(EG－I)，experimental group 2 (EG－II)，experimental group 3(EG－III)and control group(CG).The experimental groups were injected with GnRH－A antigen 1.0 m L at different doses(100 μg/m L，100 μg/m L and 50 μg/m L)，respectively，and the rabbits of EG－II and EG－III groups were re－injected at the original doses at the third week.Serum GnRH antibody titer，follicle－stimulating hormone(FSH)and luteinizing hormone(LH)concentrations were determined by ELISA.ResultsSerum GnRH antibody titers were detected in three experimental groups after 10 d of injecting GnRH－A，but not in the control group.The antibody titers of EG－I，EG－Ⅱand EG－Ⅲreached a peak level on d30 and d40～d50，respectively.The antibody titers of EG－II were higher than that of EG－I and EG－III(P＜0.01)during the period from 40 days to 70 days.LH concentration of EG－II exceeded other groups at 30 d－50 d.FSH concentrations of EG－II and EG－III reached the peak on 40 d，EG－II FSH was higher than other groups(P＜0.05).There was no significant difference between EG－Iand CG.ConlusionInjecting GnRH－A to rabbits may apparently improve GnRH antibody titer，enhance LH and FSH synthesis and secretion. Strengthening injection is more effective，lasting for about 40 days，and is related with the injecting dosage.

Gonadotropin;Releasing hormone analogues－A(GnRH－A);Luteinizing hormone;Folliclestimulating hormone;Female rabbit

S852.2

A

1005－4847(2010)03－0247－04

2009－09－27

国家民委2007年度重点资助项目(编号:MW 2007－ZD－027)。

魏锁成(1962－)，男，教授，研究方向:动物医学和动物生殖生物技术。E－mail:weisc668@163.com

赵兴绪E－mail:zhaoxx@gsau.edu.cn