小鼠心梗模型的建立与无创评价

刘建，范慧敏，汪进益，张治国，曹浩，兰琴，史乾，唐光亮，刘中民

(同济大学附属东方医院心胸外科，上海 200120)

研究报告

小鼠心梗模型的建立与无创评价

刘建，范慧敏，汪进益，张治国，曹浩，兰琴，史乾，唐光亮，刘中民

(同济大学附属东方医院心胸外科，上海 200120)

目的建立小鼠的心肌梗死模型，提高动物存活率，并使用心脏超声进行无创心功能评价。方法昆明雄性小鼠20只，气管插管后由左侧第4肋间进胸，结扎冠状动脉左前降支建立小鼠心肌梗死模型，在模型建立的前1 d和术后1 d、1周分别使用心脏超声检测左室收缩末直径、舒张末直径、缩短分数和射血分数，并于术后第8天进行病理检查。结果小鼠心肌梗死模型建立过程中早期死亡率10%(2/20)，术后1周内死亡率15%(3/ 20)，经过超声评价，造模成功率为75%(15/20)。小鼠心功能明显下降，射血分数由手术前的(92.1±3.45)%下降到术后1周的(49.8±14.20)%，缩短分数由手术前的(61.4±2.85)%下降到(26.1±9.01)%;心室明显扩大，左室收缩末直径由(13.9±1.98)μm扩大到(36.5±7.37)μm，舒张末直径由(35.9±3.12)μm扩大到(48.9± 6.05)μm。病理学检查见明显瘢痕形成。结论通过结扎冠状动脉左前降支的方法建立了小鼠心肌梗死模型并可以使用超声心动图评价这一模型。

小鼠;模型，动物;心肌梗死;超声心动图

急性心肌梗死是当代社会的多发病常见病，人们通过制作动物模型，为研究人心肌梗死的发病机制以及开展新疗法提供基础。以往倾向使用犬、猪、家兔等大中型动物来制备模型，但这一类动物价格比较贵，实验成本高。随着转基因动物研究的进展，越来越多的研究倾向于选择基因敲除小鼠作为动物模型［1］。冠状动脉结扎法是较为确切的一种制作小动物心肌梗死模型的方法［2］。但目前国内对于小鼠的心肌梗死模型的建立研究较少，缺乏一种比较简便的模型制作方法以及无创的术后评价手段，本文对此进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物:昆明雄性小鼠20只，体质量(25±5)g，来源于中科院上海实验动物中心【SCXK(沪)2002—0010】。无菌手术在上海中医药大学实验动物科学部屏障动物实验设施进行【SYXK(沪)2004－0005】，并按实验动物使用的3R原则给予人道的关怀。

1.1.2 主要试剂与仪器:盐酸氯胺酮注射液(上海中西药业股份有限公司)，利多卡因注射液(上海禾丰有限公司)，硫酸阿托品注射液(上海禾丰有限公司)，40%分析纯甲醛(上海虹光化工厂)，甲苯噻嗪(Sigma公司)。高分辨率小动物超声系统(VisualSonics®Vevo770®)，倒置显微镜(Nikon公司)，江湾I型小动物呼吸机(上海第二军医大学生理学研究所)，MPA生物信号采集分析系统(上海奥尔科特生物科技有限公司)，显微外科手术器械(苏州医疗器械厂)。

1.2 方法

1.2.1 麻醉与术前准备:将100 mg氯胺酮与10 mg甲苯噻嗪混合于生理盐水中，配制成10 m L的麻醉合剂。根据小鼠体重，每10 g给予0.1 mL上述合剂。小鼠肌肉松弛充分后取仰卧位将头部和四肢固定于手术台上，将三根电极分别固定于两上肢与右下肢，连接到MPA系统上，连续描记标准的II导联心电图。皮下注射少量阿托品减少气管分泌物，对颈正中和左前胸进行常规备皮消毒，在气管喉结下方横行切开，分离显露气管，在第3、4软骨环间做气管切开，使用22号套管穿刺针鞘进行气管插管并连接呼吸机，调整呼吸参数为(吸呼比1∶1.5，呼吸频率100次/分，潮气量为0.4～0.6 m L)。

1.2.2 手术方法:小鼠改右侧卧位，在距胸骨左缘0.3 cm处沿4、5肋间做横行切口进胸，暴露心脏，为保护小鼠膈神经，不游离过多心包，仅在肺动脉主干与左心耳交界下方切开少许心包，以左心耳下缘为标志，平左心耳前下角以8－0 proline丝线向右缝针，进针深度1 mm左右，宽度1～1.5 mm，缓慢结扎以免撕裂心肌(结扎前皮下注射少量利多卡因)。结扎后观察心室前壁变化，一般1 min左右左室前壁局部出现苍白，部分小鼠出现短暂室性心律失常，给予利多卡因局部喷洒。动态观察II导联心电图波形变化与病理性Q波出现与否。结扎满意后使用3－0线逐层关闭胸腔。断开呼吸机，胸外按压数下帮助小鼠恢复自主呼吸后拔除气管插管，简单清理呼吸道，用气管周围肌肉闭合气管，3－0线缝合皮肤。术后将小鼠放置于温毯上过夜。

1.2.3 心脏超声评价:术前1 d与术后1 d、1周将小鼠以1%异氟烷吸入麻醉后仰卧位固定，取胸骨旁短轴观切面，M型超声模式下记录左室收缩末直径(end systolic dimension，ESD)，舒张末直径(end dilation dimension，EDD)，以及反映心室收缩功能的射血分数(ejection fraction，EF)，缩短分数(fractional shortening，FS)。

1.2.4 病理学观察:术后1周检测完心功能后处死所有小鼠(同时使用未手术的小鼠作为对照)，留取心脏标本，从心脏中部垂直与心脏长轴横切左心室石蜡包埋，自心底向心尖部每隔1 μm切片，HE染色观察。

2 结果

2.1 小鼠术后存活情况

小鼠冠状动脉结扎术中早期死亡率为10%(2/ 20)，其中1只由于结扎位置偏高，引起室颤不能转复心律而死亡，另1只由于进针过深穿破心脏引起失血性休克而死亡。术后1周内又陆续有3只死亡，其中2只尸检发现胸腔内发现血凝块，进一步对心脏进行解剖发现左室前壁近心尖肌肉坏死处有明显破口，另外1只死于肺部感染，但解剖心脏也有明显瘢痕区形成。术后最后存活小鼠15只，存活率75%。

2.2 无创心功能检测

术后1周存活的小鼠与术前1 d相比心功能有显著下降，表现在左心室前壁变薄，心室射血分数与缩短分数下降，心室腔扩大(P＜0.01，有统计学意义);而术后1 d与术前并无明显差异(P＞0.05，无统计学意义)(表1)。

2.3 心肌组织病理形态学

常规HE染色后，与正常小鼠心肌组织比(图1A)，术后1周小鼠心肌组织在显微镜下(图1B)可见其呈区域性变性坏死，病变区肌纤维排列紊乱，肌丝断裂溶解，细胞核固缩碎裂，间质充血水肿明显，有炎症细胞浸润，存活的心肌细胞呈岛样分布，周围纤维肉芽组织增生，坏死心肌为纤维组织取代。图1见彩插3。

表1 小鼠手术前后心功能与心室腔大小变化(n=15，±s)Tab.1 Changes of heart volume and function in the mice (n=15，±s)

表1 小鼠手术前后心功能与心室腔大小变化(n=15，±s)Tab.1 Changes of heart volume and function in the mice (n=15，±s)

测量时间Measurement of time术前1 d One day before operation术后1 d One day after operation术后1周One week after operation射血分数(%)EF 92.1±3.45 90.4±5.62 49.8±14.20缩短分数(%)FS 61.4±2.85 58.4±4.33 26.1±9.01左室舒张末直径EDD(μm)35.9±3.12 40.5±5.22 48.9±6.05左室收缩末直径ESD(μm)13.9±1.98 14.4±4.25 36.5±7.37

3 讨论

由于小鼠易于饲养，繁殖力强，周期短，因而几乎所有的转基因动物都采用小鼠作为动物源［3］。许多心血管病研究方面的新进展都是最先利用小鼠作为动物模型。但是小鼠制作心梗模型仍然具有一定的难度，与大鼠及其他大中型动物相比，小鼠生命力更弱，手术耐受差，术后评估效果更难［4］。因此，我们在大鼠成功制作模型并评价的基础上［5］，对小鼠心梗模型的制作方法进行了研究。

常规的心梗模型制作方法有冠脉结扎法、左室电灼法、液氮冷冻法和药物法等。其中冠脉结扎法是通过闭塞冠状动脉引起心肌缺血梗死，进而心功能下降，比较符合临床心肌梗死发病的实际生理特征，能比较好的适应临床上对心肌梗死病理过程的研究需要，而且该方法效果比较成熟，故本实验采用这一方法。

成功的麻醉与良好的人工呼吸是制作心梗模型的前提。本实验采用自己配制的氯胺酮与甲苯噻嗪的麻醉合剂，麻醉起效快，大约腹腔注射后5 min可以取得比较好的麻醉与肌松效果;一般可以稳定维持一个小时左右，足够满足手术需要，即使出现个别小鼠出现麻药耐受，追加首剂1/3也基本不会引起麻醉意外［6］;小鼠术后苏醒很快，有助小鼠恢复;此外，甲苯噻嗪有一定的镇静作用，使用后小鼠心率有所减慢，在一定程度上降低了手术时结扎的难度。本实验经颈部行气管切开并经该切口连接呼吸机，以往有文献报道使用经口气管插管的方法可以减少出血等手术并发症，但本实验中发现小鼠颈部血管分布较少且清晰，颈部解剖结构简单，层次清楚，气管切开基本不引起出血，切开后插管效果明确，不会出现经口插管出现的误入食道的现象;实验中如出现气管分泌物堵塞引起呼吸不畅的现象，可以立刻将套管针鞘取出进行清理，复插方便;气管切开穿刺针不经过喉，不会引起术后喉头水肿进而窒息的情况;手术中要注意减少气道分泌物，本实验中通过插管前皮下注射少量阿托品来预防［7］。本实验中采用暖光源，对小鼠的麻醉中保温也起到了一定效果，经过初期探索后，在实验中小鼠并未出现因麻醉与人工呼吸死亡的现象。

成功结扎冠脉是模型制作的关键所在。首先是结扎位置，精确操作，并力争在同一高度结扎是获得比较均一的模型的关键;第二是进针深度的控制，因为小鼠心室壁较薄，穿刺过深直接导致心脏破裂出血，一般控制在0.5～1 mm;另外结扎动作要熟练迅速，力争一次成功，时间拖得过长或者重复结扎会增加发生室性心率的几率。开胸后左肺与膈叶的保护也非常重要，肺损伤是小鼠术中与术后早期死亡的一个重要原因，开胸后适当减小潮气量与肺膨胀，需要牵拉与推开肺组织时要使用盐水纱布或者棉花作为衬垫，千万不要使用锐利器械直接牵拉肺组织。

小动物的常规心功能检查手段有导管心腔内压力测量、朗根道夫灌注法等［8］，但均为有创，后者更是要处死动物，将心脏离体操作，操作复杂费时，且不能连续动态观察小鼠的心功能。本实验中我们采用心超无创的方法，连续动态观察小鼠手术前后的心功能，不失为一种较好的小鼠心梗模型评价方法［9］。

(本文图1见彩插3。)

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Estab lishm ent and Non-Invasive Assessm ent of a M ouse M odel of M yocardial In farction

LIU Jian，FAN Hui－min，WANG Jin－yi，ZHANG Zhi－guo，CAO Hao，LAN Qin，SHI Qian，TANG Guang－liang，LIU Zhong－min
(Department of Cardiovascular and Thoracic Surgery of East Hospital Affiliated to Tongji University，Shanghai 200120，China)

Objective To establish a standardized mouse myocardial infarction model with a high survival rate，and non－invasively evaluate its cardiac function by echocardiography.M ethods A total of 20 Kunming male mice were enrolled into this study.The left anterior descending coronary artery was ligated through the left fourth intercostal space after intubation.The echocardiographic assessment of myocardial infarction and heart function was performed 1 day preoperatively，1 day and 1 week postoperatively.Pathological examination was performed 8 days postoperatively.The ejection fraction(EF)，shortening fraction (FS)，end systolic dimension(ESD)，and end diastolic dimension(EDD)were recorded and analyzed.Results The acute and one－week mortality rates were 10%(2/20)and 15%(3/20)，respectively.The echocardiography showed that the success rate of establishment of the infarction model was 75%(15/20).The heart function of the mice was markedly impaired.The EF and FS were significantly decreased from(92.1±3.45)%and(61.4±2.85)%to(49.8±14.20)%and(26.1±9.01)%(P＜0.001)，while EED and ESD were increased significantly［(35.9±3.12)μm and(13.9±1.98)μm vs.(48.9±6.05)μm and(36.5±7.37)μm，P＜0.001，respectively］.Pathological examination confirmed scar formation.Conlusions A mouse model of myocardial infarction has been successfully established by surgical ligation of the left anterior descending coronary artery and the heart functions can be evaluated by echocardiography.

M ice;Animal model;Myocardial infarction;Echocardiography

R654.1

A

1005－4847(2010)03－0196－03

2009－10－23

国家自然科学基金项目(30471719);上海市科委重点项目(064119504)。

刘建(1984－)，男，硕士，研究方向:顽固性心衰的外科治疗及移植免疫。Email:4871174@qq.com

刘中民。Email:zhongmin－liu@sina.com