影响野生型Canton S果蝇睡眠时间的相关生理因素

李廷利，许光辉，徐瑞鑫

(黑龙江中医药大学药学院，哈尔滨 150040)

研究报告

影响野生型Canton S果蝇睡眠时间的相关生理因素

李廷利，许光辉，徐瑞鑫

(黑龙江中医药大学药学院，哈尔滨 150040)

目的探讨影响果蝇睡眠时间的相关生理因素。方法选择野生型Canton S果蝇为实验对象，利用果蝇活动监测系统(DAMS)，以5 min为单位自动统计一次果蝇活动次数，若5 m in内活动次数为零，认为果蝇处于睡眠状态，计为果蝇的睡眠时间，累积计算果蝇24 h睡眠总时间为指标，分别观察了日龄(7日龄)相同，而性别不同和性别(雌性)相同，而日龄(2，7，12，17，22，27和32日龄)不同果蝇的24 h睡眠总时间。结果①同一日龄(7日龄)不同性别的果蝇之间白天(12 h)及夜间(12 h)平均睡眠时间的长短存在着显著差异。雌果蝇白天(12 h)平均睡眠时间短于雄果蝇，而夜间(12 h)平均睡眠时间长于雄果蝇。雌果蝇白天(12 h)平均睡眠时间显著短于夜间平均睡眠时间(P＜0.05);而雄果蝇白天(12 h)平均睡眠时间与夜间(12 h)平均睡眠时间基本持平。②同一性别(雌性)不同日龄的果蝇，随着日龄的增加，其白天(12 h)平均睡眠时间有逐渐缩短的趋势，27日龄的果蝇睡眠时间减少相对明显，32日龄果蝇的睡眠时间有所恢复，相互之间存在着显著差异(P＜0.05)。夜间(12 h)平均睡眠时间有逐渐延长的趋势，27日龄果蝇的夜间平均睡眠时间有所减少，32日龄果蝇的夜间平均睡眠时间相对有所恢复，相互之间存在着显著差异(P＜0.05)。结论性别与日龄等生理因素对果蝇24 h睡眠时间有显著的影响。

果蝇;睡眠时间;睡眠节律;果蝇活动监测仪

果蝇具有清晰的遗传背景;简约的神经系统;较短的生命周期;较强的繁殖能力;丰富的行为菜单和方便的基因操作等生物学特性，以往其作为一个经典的模式生物在遗传学等研究领域广泛应用。近十年来，大量研究结果表明，果蝇具有哺乳动物共有的睡眠生物特征［1］，将其作为模式生物应用于睡眠及睡眠发生机制的研究［2－4］。

为了利用果蝇这一模式生物开展睡眠有关方面的研究，我们对影响果蝇睡眠时间的相关生理因素进行了实验研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物:野生型Canton S品系黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)由北京大学生命科学学院提供。

1.1.2 果蝇培养基:蒸馏水460 g，玉米粉42 g，蔗糖31 g，琼脂3 g，酵母粉3 g，丙酸3 m L。

1.1.3 实验仪器:果蝇群体活动监测系统(DAMS，美国Trikinetics公司)，该系统由果蝇活动监测器与数据采集分析软件组成。

1.2 方法

1.2.1 实验环境:温度:(24±1)℃;湿度:50%～60%;光照:12 h自动亮－暗循环(7:00开灯，19:00关灯)。

1.2.2 果蝇睡眠监测方法:将实验果蝇转入细小玻璃管(内径5 mm，长6.5 cm，一端内装有果蝇的培养基并用石蜡或黑色小帽封住，另一端用棉球封住)内，每只小管装一只果蝇。然后将细小玻璃管嵌入到果蝇活动监测器上。一个监测器可同时监测32只果蝇，监测器直接连在计算机上，监测器发出红外光束横穿细小玻璃管中部，果蝇每次从玻璃管中部经过时阻断红外光束，计算机自动记录1次，DAM系统数据采集软件每隔5 min自动记录一次果蝇活动次数。若持续5 min以上活动次数记录为零，即果蝇静止时间持续5 min以上时，此休息状态符合睡眠行为标准，认为果蝇处于睡眠状态［5］。在实验12 h前，将果蝇装入小管内适应环境。

1.2.3 性别对果蝇睡眠时间的影响:收集12 h内羽化的果蝇，雌雄分开饲养，随机分布选择7日龄的雌雄果蝇32只，移入到果蝇睡眠监测管(于监测前适应12 h)中，对雌雄果蝇分别进行活动监测，按上述果蝇睡眠判断标准，计算其总睡眠时间。同一实验重复3次。

1.2.4 日龄对雌果蝇睡眠时间的影响:收集12h内羽化的果蝇，雌雄分开饲养，随机分别选择2、7、12、17、22、27日龄和32日龄的雌果蝇各32只，移入果蝇活动监测管(于监测前适应12 h)中，对不同日龄的果蝇分别进行活动监测，计算其睡眠总时间。同一实验重复3次。

1.2.5 数据处理与分析:通过EXCEL软件对实验数据进行处理。以时间为横坐标，以实验果蝇每小时睡眠时间(单位:分钟/小时)的平均值为纵坐标绘图。采用SPSS13.0分析软件，不同类型的数据先通过正态分布检验，各组数据符合正态分布，进行LSD法分析。

2 结果

2.1 性别对果蝇睡眠时间的影响

实验结果见图1和表1。

图1 7日龄果蝇睡眠节律变化Fig.1 The changes of sleep and awake in 7－day－old drosophila

表1 7日龄雌、雄果蝇平均睡眠时间比较(±s，min/h)Tab.1 Comparison of the average sleep time between 7－day－old male and female dosophila(±s，min/h)

表1 7日龄雌、雄果蝇平均睡眠时间比较(±s，min/h)Tab.1 Comparison of the average sleep time between 7－day－old male and female dosophila(±s，min/h)

注:同日龄(7日龄)的雌、雄果蝇在白天和夜晚的平均睡眠时间相比较，*为P＜0.05;同日龄(7日龄)的雌和雄果蝇在白天或夜晚的平均睡眠时间相比较，△△为P＜0.01。*Represents P＜0.05，comparison of the average sleep time between 7－dayold male and female dosophila;△△represents P＜0.01，comparison of the average sleep time of day and night in 7－day－old male or female dosophila.

性别Gender白天平均睡眠时间Average sleep time of day夜晚平均睡眠时间Average sleep time of night雌Female 14.4±11.7*△△42.6±15.3雄Male 36.1±20.6 38.5±17.0

实验结果表明，同一日龄(7日龄)不同性别的果蝇之间白天(12 h)平均睡眠时间的长短存在着显著差异。雌果蝇白天(12 h)平均睡眠时间短于雄果蝇(P＜0.01)。雌果蝇白天(12 h)平均睡眠时间显著短于夜间平均睡眠时间(P＜0.05);而雄果蝇白天(12 h)平均睡眠时间与夜间(12 h)平均睡眠时间基本持平。

2.2 日龄对雌果蝇睡眠时间的影响

实验结果见图2(彩插4)、图3和表2。

实验结果表明:同一性别(雌性)不同日龄的果蝇，随着日龄的增加，其白天(12 h)平均睡眠时间有逐渐缩短的趋势，27日龄的果蝇睡眠时间减少相对明显，32日龄果蝇的睡眠时间有所恢复，相互之间存在着显著差异(P＜0.05)。夜间(12 h)平均睡眠时间有逐渐延长的趋势，27日龄果蝇的夜间平均睡眠时间有所减少(P＜0.05)，32日龄果蝇的夜间平均睡眠时间相对有所恢复。

图3 不同日龄雌果蝇平均睡眠时间Fig.3 The average sleep time during the day and night with age in female drosophila

表2 不同日龄雌果蝇睡眠时间的变化(±s，min/h)Tab.2 The changes of sleep time in female drosophila of different ages(±s，min/h)

表2 不同日龄雌果蝇睡眠时间的变化(±s，min/h)Tab.2 The changes of sleep time in female drosophila of different ages(±s，min/h)

注:不同日龄果蝇与7日龄果蝇的白天(12 h)或夜间(12 h)平均睡眠时间相比较(LSD检验)，*为P＜0.05.*Represents P＜0.05 vs.7－day－old drosophila(One－way ANOVA，LSD test).

日龄Day白天平均睡眠时间Average sleep time during the day夜晚平均睡眠时间Average sleep time during the night 2 21.4±9.1*39.1±9.4 7 14.4±11.7 42.6±15.3 12 18.4±11.3 47.3±8.9 17 15.6±13.6 45.4±10.9 22 13.2±4.5 46.1±10.0 27 8.7±3.2 31.1±9.2*32 12.8±2.4 35.8±6.1

3 讨论

睡眠是一个基本的生物学过程，涉及有机体的功能和对不断变化的外界环境的反应。

果蝇作为睡眠研究的模式生物关键在于它是否具有真正意义上的睡眠。在哺乳动物和鸟类，睡眠的判定是直观的，通过脑电、肌电、眼电等电生理现象可以区分其清醒和睡眠两种状态。然而对于无脊椎动物，由于缺乏产生脑电的神经结构，所以只能通过行为标准去界定它们是否存在睡眠状态。

目前界定睡眠的行为学标准［2，6］:静止时间的延长;具有特定的姿势和休息的位置;激醒反应阈的提高;在外界刺激下可快速可逆;具有内稳态调节——睡眠剥夺后对睡眠需求的增加［7］;具有昼夜节律性。用这些标准研究果蝇发现，果蝇在它类似睡眠的休息状态下，表现出对轻微的刺激没有反应。它们在行为学实验中表现出活动减少和唤醒阈值提高，大多数果蝇距离食物1 mm、背对着食物的方向静止不动，仅腹部有一定的呼吸，散在鼻动或是极少数出现四肢震颤和抽搐，果蝇每天都保持这种睡眠状态很长时间［8］，并且主要的休息时间发生在黑夜的前半夜。但是在较大的刺激下，可以被唤醒。当睡眠被剥夺(手动或自动)后，果蝇会代偿性增加睡眠时间，第二天它们表现出休息需要的增加和一个明显的代偿式休息延长，表现出内稳定调节。如同哺乳动物一样睡眠回跳发生在睡眠剥夺结束时，相对于短时剥夺(6 h)，长时剥夺(12～24 h)更为显著，恢复的睡眠仅仅是它被剥夺时间的一个片段［9］。这种自我平衡稳态的睡眠行为反弹与睡眠损失有关，与刺激的停止无关。

随着果蝇活动监测系统的应用，果蝇的睡眠状态得以监测、睡眠时间得以量化。早期应用超声活动监测仪进行果蝇睡眠行为的监测，但是这种方法只能对一只果蝇进行连续的、高分辨率的监测。目前普遍采用自动红外监测仪(DAMS)来监测果蝇的睡眠行为和计算果蝇的睡眠时间，其可以同时监测多只果蝇的睡眠时间。DAMS监测系统包括监测器和数据采集分析系统。

经过大量研究，得出了一致结论:果蝇静止时间持续5 min以上，此状态符合睡眠行为标准。因此，利用DAMS监测，果蝇静止不动长于5 m in时，被定义为果蝇处于睡眠状态［3，10］，并以此计算其24 h的总睡眠时间。

本研究以野生型Canton S果蝇为观察对象，利用DAMS系统，观察了性别与日龄对果蝇睡眠时间的影响，研究结果提示我们，在今后利用果蝇这一模式生物开展睡眠研究时，要充分考虑到相关生理因素对果蝇睡眠时间的影响。

(本文图2见彩插4。)

［1］Hendricks JC，Finn SM，Panckeri，KA，et al.Rest in drosophila is a sleep－like state［J］.Neuron.2000，25(1):129－138.

［2］Hendricks JC，Sehgal A，Pack AI.The need for a simple animal model to understand sleep［J］.Prog Neurobiol，2000，61(4): 339－351.

［3］Greenspan RJ，Tononi G，Cirelli C，et al.Sleep and the fruit fly［J］.Trends Neurosci，2001，24(3):142－145.

［4］Sheeba V，Fogle KJ，Kaneko M.Large ventral lateral neurons modulate arousal and sleep in Drosophila［J］.Curr Biol，2008，18(20):1537－1545.

［5］Andretic R，P.J.Shaw PJ.Essentials of sleep recordings in Drosophila:moving beyond sleep time［J］.Methods Enzymol，2005，393:759－772.

［6］Campbell S，Tobler I.Animal sleep:a review of sleep duration across phylogeny［J］.Neurosci Biobehav Rev，1984，8:269－300.

［7］Tobler I.Effect of forced locomotion on the rest－activity cycle of the cockroach［J］.Behav Brain Res.1983，8:351－360.

［8］Ho KS，Sehgal A.Drosophila melanogaster:an insect model for fundamental studies of sleep［J］.Methods Enzymol.2005，393: 772－793.

［9］X Huber R，Hill SL，Holladay C，et al.Sleep homeostasis in Drosophila melanogaster［J］.Sleep.2004，27:628－639.

［10］Shaw PJ，Cirelli C，Greenspan RJ，et al.Correlates of sleep and waking in Drosophila melanogaster［J］.Science，2000，287.: 1834－1837.

Effects of Gender and Age in Days on the Sleep Rhythm of Drosophila melanogasters

LI Ting－li，XU Guang－hui，XU Rui－xin
(Pharmaceutical College，Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine，Haerbin 150040，China) Corresponding author:LI Ting－li

ObjectiveTo exp lore the physiological factors affecting the sleep duration of Drosophila melanogaster.M ethods Canton－S wild type Drosophila was chosen as the experimental object，and the sleep duration of Drosophila was determined by an infrared activity monitoring system(DAMS).Sleep was defined as any period of uninterrupted behavioral immobility lasting longer than 5 minutes.All the immobility time was counted together as the sleep duration during 24 hr.Drosophila of the same age(7－day old)and different genders，as well as of the same gender (female)and different ages(2，7，12，17，22，27 and 32－day old)were observed during a 24 hr－day to make a comparison of their sleep duration.Results①There was a significant difference between 7－day old males and females，either in day－time(12 hr)or in the night－time(12 hr).Female drosophila had a shorter sleep duration in day－time(12 hr)than that of males，while it was longer than that of males in night－time(12 hr).On the other hand，the females slept significantly less in day－time(12 hr)than in night－time(12 hr)(P＜0.05)compared with the males.②A long with the increasing of age，the sleep duration became much longer in female drosophila.But there was a tendency that sleep period during day－time becoming shorter，especially in 27－day－old drosophila.When the age reached up to 32 days，the sleep period was relatively recovered.All those changes had a significant difference(P＜0.05)between each other.Similarly，27－day－old drosophila had a less sleep duration in night－time which was recovered to a certain extent in 32－day drosophila，while the average sleep period in night－time was somehow increasing.We also derive significant difference(P＜0.05)inthese discrepancy.ConlusionGender and age and other physiological factors significantly affect the sleep time of flies during 24 hr.

Drosophila melanogaster;Sleep time;Sleep rhythm;DAMS

Q－331

A

1005－4847(2010)02－0105－04

2009－09－28

国家自然科学基金面上项目(编号:30672634)。

李廷利，教授，男，汉族，黑龙江哈尔滨人，医学博士，博士生导师，主要从事天然药物及复方生物活性的研究。Email: litingli8888@sohu.com