超微超顺磁性氧化铁纳米粒的制备及性能研究

刘国华，陈燕明，蔡 庆，陈晓军，洪若瑜

（1.南京医科大学附属苏州市立医院东区呼吸科，江苏苏州 215001；2.南京医科大学附属苏州市立医院东区放射科，江苏苏州 215001；3.苏州大学化学化工学院，江苏苏州 215123）

超微超顺磁性氧化铁纳米粒的制备及性能研究

刘国华1，陈燕明1，蔡 庆2，陈晓军1，洪若瑜3

（1.南京医科大学附属苏州市立医院东区呼吸科，江苏苏州 215001；2.南京医科大学附属苏州市立医院东区放射科，江苏苏州 215001；3.苏州大学化学化工学院，江苏苏州 215123）

目的：制备超微超顺磁性氧化铁纳米粒，并研究其物理、磁学性质及传递特性，探讨其作为磁共振阴性对比剂的可能性。方法：共沉淀一步法制备葡聚糖包被的四氧化三铁纳米粒，采用X射线粉末衍射法(XRD)分析其内部晶体结构，傅立叶红外光谱仪(FT－IR)分析其表面结构，透射电镜(TEM)及动态激光粒度仪测量其大小，振动样品磁强计(VSM)检测磁化率等参数。此外，采用原子吸收光谱仪检测家兔血和不同脏器中的样品铁含量，MRI观察注射样品后肝、淋巴结的增强效果。结果：所得样品核心为四氧化三铁晶体，表面包覆葡聚糖，核心粒径6～8 nm，整体颗粒直径为33 nm，样品铁含量为0.2 mmol/L。磁化曲线表现为超顺磁性，饱和磁化强度为48.1 emu/g。样品在家兔体内血循环时间较长(＞6 h),主要分布至脾、肝、肺、心、淋巴等网状内皮系统，注射样品后肝、淋巴结在T2WI信号明显降低。结论：实验表明，制备的样品可作为一种新型的磁共振阴性造影剂，广泛用于肝脾、淋巴结等多种疾病的诊断和治疗。

超微超顺磁性氧化铁纳米粒；物理性质；磁学性质；传递特性；磁共振阴性对比剂

随着科技的进一步发展，纳米生物材料被广泛研究并投入临床，其中超微超顺磁性氧化铁纳米粒（ultrasmall superparamagnetic iron oxide，USPIO）作为一种新型的磁性纳米生物材料，常用于磁共振的阴性对比剂、示踪剂及靶向药物载体等，但该产品价格昂贵，国内市场难觅踪影，本实验采用化学共沉淀一步法制备USPIO，从物理、磁学性质、传递特性等方面进行研究，探讨其作为磁共振阴性对比剂应用于临床的可能性。

1 仪器与试药

1.1 仪器

H－600－Ⅱ型透射电镜（transmission electron microscopy，TEM）（日本日立公司），D/max－ⅢC型X射线粉末衍射仪（X-ray，diffraction，XRD）（日本理学公司），220FS/ZS 型原子吸收光谱仪（美国varian spectra公司），Avatar 360型傅立叶红外光谱仪（Fouriertransform infrared，FT-IR）（美国 Nicolet公司），HPPS 5001型动态激光粒度仪（英国Malvern公司），BHV-55型振动样品磁强计（vibrating sample magnetometer，VSM），德国Philips 1.5T超导MR系统。

1.2 试药

三氯化铁、氨水、葡聚糖T20、水合肼均为分析纯，国药集团化学试剂公司生产；硝酸（分析纯）为江苏金城试剂公司产品；高氯酸（分析纯）为桃油化工厂产品。

2 方法与结果

2.1 共沉淀一步法制备样品

共沉淀一步法制备外包葡聚糖的四氧化三铁纳米粒（USPIO）见图 1，具体步骤：将三氯化铁和氯化亚铁（Fe3+∶Fe2+摩尔比1.75∶1）和2.5 g葡聚糖T20混合，加入0.5 ml水合肼，溶解在30 ml去离子水中，恒温磁力搅拌器搅拌，滴加26.5%氨水10 ml，搅拌15 min，缓慢滴加氨水调节pH至10，升温至60℃继续反应3 h，冷却后7 000 r/min离心20 min以除去大颗粒，取出上层磁流体，用截留分子量为50 000的透析膜透析24 h以除去磁流体中的剩余物。超声振荡5 min，将磁流体60℃真空干燥，分装后灭菌，置于4℃冰箱，备用。

图1 共沉淀一步法制备的样品

2.2 样品的性能研究

2.2.1 物理性质研究

2.2.1.1 TEM观察粒子的形态和直径 取适量磁流体样品滴加于已制膜的铜网上，滤纸吸除多余的液体，干燥置于TEM观察孔下观察粒子的形态和直径。

2.2.1.2 XRD分析粒子的晶体结构 取适量真空干燥的样品颗粒研细成粉末，置于XRD进行扫描，将所得图谱与JCPDS标准卡片相比，确定样品是否为四氧化三铁晶体结构。

2.2.1.3 样品含量测定 原子吸收光谱仪测定样品中的铁含量。

2.2.1.4 FT-IR分析粒子的表面结构 取适量真空干燥的样品颗粒研细成粉末，加入KBr压片，充分混合直至形成KBr小丸，用FT-IR分析粒子的表面结构。

2.2.1.5 样品的总体平均粒径测定 取适量磁流体样品置于粒度仪比色杯中，采用动态激光粒度仪测定总体平均粒径。

2.2.2 磁学性质研究

取适量磁流体样品置于VSM仪内，测定磁化曲线。

2.2.3 传递性质研究

2.2.3.1 样品溶液在家兔体内分布测定 取家兔21只，随机分成7组，每只按1.25 ml/kg的剂量由耳缘静脉注射样品溶液，给药后 0.5、1、2、3、6、9、12 h 后分别从耳缘静脉收集全血1～2 ml，置于肝素抗凝的试管中，后处死家兔，剖取其心、肺、肝、脾、淋巴结，预处理后，用原子吸收光谱仪测定各标本中铁含量。

2.2.3.2 组织标本中摄入的样品粒子观察 取肝、脾、肺、淋巴结标本，采用4%戊二醛固定，丙酮逐级脱水，环氧树脂包埋，作50 nm左右的超薄切片，染色后电镜观察。

2.2.4 注射样品前后肝淋巴结的增强效果

MR 扫描参数：SE 序列，T2WI（TR/TE 为 1 800/60 ms），矩阵 256×256，层厚 3 mm。

2.3 统计学分析

统计学分析采用SPSS 12.0软件，实验结果用平均值±标准差（±s）表示，组间差异采用t检验法进行比较。

2.4 结果

2.4.1 样品的物理性质

2.4.1.1 TEM显示，四氧化三铁核心部分为分散均匀、圆整的颗粒，以TEM标尺100 nm，其粒径不超过10 nm（6～8 nm），见图 2。

图2 样品的TEM图谱

2.4.1.2 XRD显示，图中出现一系列特征峰，分别为2.964（220）、2.525（311）、2.092（400）、1.717（422）、1.612（511）、1.478（440）、1.276（533），与四氧化三铁JCPDS标准卡片的位置一致，可确定样品核心为四氧化三铁晶体结构，见图3。

图3 样品的XRD图谱（A：Fe3O4纳米粒；B：样品 1；C：样品 2；D：样品 3；E：样品 4）

2.4.2 样品铁含量测定结果

原子吸收光谱仪测得样品铁含量为0.2 mmol/ml。

2.4.3 FT-IR分析结果

FT-IR分析结果显示，外包葡聚糖的四氧化三铁出现了一些新的吸收峰，如 3 300、2 925、1 636、1 427 cm-1及 1 011、1 111、1157 cm-1，与纯葡聚糖粉末吸收峰位置大致相同，表明葡聚糖主要以氢键、范德华力及静电作用等方式与四氧化三铁纳米粒子结合，见图4。

图4 样品的FT-IR图谱（A：Fe3O4纳米粒；B：葡聚糖；C：样品）

2.4.4 样品的总体平均粒径测定结果

动态激光粒度仪测得样品的总体平均粒径为33 nm。

2.5 样品的磁学性质

VSM测得的样品磁化曲线显示，样品矫顽力为0，无磁滞现象，表现为超顺磁性，样品饱和磁化强度为48.1 emu/g，见图5。

图5 样品的磁化曲线图谱

2.6 样品的传递性质

2.6.1 铁元素浓度测定结果

样品注射后，铁元素在兔子体内血循环时间较长，从血浆中清除较慢，6 h后血液中仍存在较高浓度铁元素，另外，样品注射后，铁元素迅速分布至各器官组织，依次为脾、肝、肺、心、淋巴结，其中，脾肝富集量最高，而在淋巴结中，6 h后铁元素含量达最高值，随后保持稳定，分别见表1、图6。

2.6.2 肝、脾、肺、淋巴结切片结果

组织标本的电镜显示，肝、脾、肺、淋巴结切片具有较高密度的粒状物，为氧化铁颗粒，见图7。

2.7 T2WI信号结果

注射样品后，可见肝、淋巴结在T2WI信号明显降低，见图8。

表1 铁元素在家兔各脏器的动态分布（n=3，μg/g）

3 讨论

USPIO作为一种新型的磁性纳米生物材料，是一种理想的磁共振阴性对比剂，近年来，学者们研究了较多的制备方法，其中较为简单有效且技术成熟者当属化学共沉淀法[1]，本实验采用共沉淀一步法，合成了USPIO样品，并通过加水合肼、超声振荡等手段，使纳米颗粒分散性更好，粒径更小。XRD显示，样品核心为Fe3O4晶体结构，TEM显示，Fe3O4分散均匀、圆整，粒径在10 nm以下（6～8 nm），小于单畴超顺磁性氧化铁颗粒的理论临界值25 nm[2]。裸露的Fe3O4纳米粒易发生团聚、沉淀，为了增加其悬浮稳定性及生物相容性，通常需对其进行表面修饰，而葡聚糖是目前常用的壳层生物大分子，具有良好的亲水性，因此，本实验亦采用了葡聚糖进行表面修饰，FT-IR显示，葡聚糖主要以氢键、范德华力及静电作用等方式与Fe3O4纳米粒紧密结合，形成稳定的磁流体[3]。包被后的Fe3O4纳米粒悬浮稳定性好，外观呈黑棕色，含量为0.2 mmol/ml，4℃冰箱放置2个月，未见絮凝及沉淀现象。外包葡聚糖的Fe3O4颗粒直径一般在纳米数量级，其颗粒大小不同将影响其磁特性、药代动力学特性及体内的分布。目前，根据颗粒大小将超顺磁性氧化铁颗粒（SPIO）分为两类[4]：一类是普通的SPIO，一般纳米颗粒直径＞50 nm；另一类是USPIO，最大直径＜50 nm。本实验动态激光粒度仪检测表明，样品的总体平均粒径为33 nm，颗粒大小符合USPIO，与国外处于临床试验阶段的AMI-227相似。VSM结果表明，样品在外加磁场下有良好的磁响应性，饱和磁化强度为48.1 emu/g，高于MR对比剂要求的最低强度标准[5]，当撤消磁场后剩磁为0，无磁滞现象，由于此时每个粒子都是一个单磁畴，磁化方向产生无规则的变化，导致超顺磁性的出现，满足了作为磁共振造影剂的基本要求。至于样品在体内的传递及分布情况，一般来说，USPIO由于其颗粒小，与血浆蛋白和调理素的作用减弱，血循环半衰期延长，故可通过毛细血管壁更广泛地分布于组织中，特别是通过毛细血管末梢进入骨髓，并通过淋巴管输送到淋巴结[6]。笔者以家兔为对象进行了试验，结果表明，铁元素在兔子体内的血循环时间确实较长（＞6 h），从血中清除较慢，另外，样品注射后，铁元素迅速分布至各组织，如脾、肝、肺、心、淋巴结，其中，脾、肝富集量最高，而在淋巴结中，6 h后铁元素含量达最高值，随后保持稳定，因此，USPIO易沉积在网状内皮细胞丰富的组织中，是一种网状内皮系统的对比剂，可用于肝、脾，特别是淋巴结的MR增强[7]。当USPIO颗粒分布于组织后，由于具有很强磁矩，可局部扩增外加磁场，使磁场不均匀，水分子弥散穿过不均匀磁场时加速了质子的失相，造成了组织的T2明显缩短，信号减低，目前主要用于T2WI成像（负性增强），而对T1影响较小（低浓度时亦有T1增强效应，高浓度时磁化率效应一定程度平衡了T1效应）[8]，本实验发现，注射样品后肝实质及淋巴结信号强度在T2WI上明显下降，提示本样品确实可作为肝、脾、淋巴结等网状内皮系统MR的阴性对比剂。

综上所述，利用共沉淀一步法制得的本样品符合USPIO特点，具有良好的物理磁学性质及传递特性，USPIO的增强扫描为其广泛用于肝、脾、淋巴结等网状内皮系统疾病的诊断奠定了基础。

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Preparation and performance study on ultrasmall superparamagnetic iron oxide(USPIO)nanoparticles

LIU Guohua1,CHEN Yanming1,CAI Qing2,CHEN Xiaojun1,HONG Ruoyu3
(1.Department of Respiration,East－section of the Affliated Suzhou Municipal Hospital of Nanjing Medical University,Suzhou 215001,China;2.Department of Radiology,East－section of the Affliated Suzhou Municipal Hospital of Nanjing Medical University,Suzhou 215001,China;3.Department of Chemistry and Chemical Engineering,Suzhou University,Suzhou 215123,China)

Objective:To study the physical,magnetic and transportable properties of USPIO nanoparticles prepared in our laboratory and explore its possibility for using as negative contrast agents in MRI.Methods:The iron oxide nanoparticles was obtained by means of co－precipitation one－step method,its inner crystal structure was analyzed by X－ray diffraction(XRD),its surface structure was analyzed by Fourier transform infrared(FT－IR),its size was measured by transmission electron microscopy(TEM)and dynamic loser scattering system,and its susceptibility was measured by vibrating sample magnetometer(VSM).The iron content in blood and various organ in rabbits at different time was measured by atomic absorption spectrometer,the enhancing－effect of liver and lymph after injecting sample was observed by MRI.Results:The diameter of dextran－coated iron oxide nanoparticles was 6－8 nm,its overall diameter was 33 nm,the iron content of sample was 0.2 mmol/L.These particles possed some characteristics of superparamagnetic,saturation magnetic intensity was 48.01 emu/g.The circulation time of sample in blood plasma of rabbit was long,it distributed in some organs,such as spleen,liver,lung,heart and lymph which had abundant of reticuloendothelial cells.The signal of T2－weighted MR images of liver and lymph decreased remarkably.Conclusion:The experimental conclusion shows the sample USPIO can be used as a promising negative MR agent for various types of liver,spleen and lymph diseases diagnosis.

USPIO;Physical property;Magnetic property;Transportable property;Negative contrast agents in MRI

R394

A

1673-7210（2010）07（a）-033－05

2010-03-31）

南京医科大学科技发展基金(编号：NY0586)。

刘国华，男，江苏苏州人，医学硕士，副主任医师，研究方向为肿瘤基础与临床。