神经组织特异表达 CTF1转基因小鼠的建立

吕 丹,陈 炜,曹兴水,张晓娟,王书美,张连峰

(中国医学科学院北京协和医学院实验动物研究所,卫生部人类疾病比较医学重点实验室,北京 100021)

研究报告

神经组织特异表达 CTF1转基因小鼠的建立

吕 丹,陈 炜,曹兴水,张晓娟,王书美,张连峰

(中国医学科学院北京协和医学院实验动物研究所,卫生部人类疾病比较医学重点实验室,北京 100021)

目的建立神经组织特异表达 CTF1的转基因模型小鼠,为研究 CTF1生物学功能及与老年痴呆等疾病发病机制的关系提供工具动物。方法把 CTF1基因插入神经组织特异的启动子 PDGF下游,构建转基因表达载体,显微注射法建立 C57BL/6J CTF1转基因小鼠。PCR鉴定转基因小鼠基因型,采用Western Blot方法鉴定CTF1在脑组织中的表达,对转基因小鼠脑组织进行石蜡切片,HE染色,显微镜观察组织结构形态的改变。结果建立了 2个不同表达水平的 CTF1转基因小鼠品系。转入的 CTF1基因在脑组织的表达水平均高于同龄对照小鼠。组织学分析显示 CTF1转基因小鼠大小脑组织基本结构形态未见异常。结论成功建立了稳定遗传的神经组织特异表达CTF1转基因小鼠品系,为 CTF1的生物学功能及与老年痴呆等疾病发病机制关系的研究提供了有力的模型工具。

心肌营养素-1;神经组织;转基因

1995年 Pennica等[1]从小鼠心脏分离的胚胎干 细胞中克隆出一种细胞因子 -心肌营养素-1(Cardiotrophin 1,CTF1)。序列同源性比较及结构分析表明,CTF1属于白细胞介素-6(Interleukin-6, I

L-6)细胞因子家族。CTF1存在于多种组织中,是一种具有广谱生物学活性的细胞因子,具有心肌肥大及心肌细胞保护作用,同时其作为一种多效性细胞因子对包括神经系统在内的其他组织皆产生广泛的生物学影响。

人 CTF1基因位于染色体 16p11.1～p11.2[2]。人 CTF1 mRNA长 1539 bp,编码 201个氨基酸组成的蛋白质,相对分子质量为 26 700,全长 CTF1蛋白没有N端分泌信号肽的疏水性序列及糖基化位点,只有小鼠 CTF1含有一个N端潜在糖基化位点。人和大鼠 CTF1氨基酸序列的同源性为 81%,人与小鼠为 79%。根据蛋白质结构分析[1,2],CTF1属于白细胞介素-6( IL-6)/白细胞介素-11( IL-11)/睫状神经营养因子 (Ciliary neurotrophic factor,CNTF)/抑瘤素 M(Oncostatin,OS M)/白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor,L IF)细胞因子家族,该家族成员在氨基酸Ⅰ级结构上有较低的同源性,但它们在Ⅲ级结构上都具有 4个α螺旋组成的螺旋束,同时该家族都通过 gpl30同源二聚体或 gpl30/ L IF受体β(L IF receptorβ,L IFRβ)异源二聚体的形成进行信号传递,有类似的生物学活性。CTF1作为I

L-6细胞因子超家族的一员,它们以糖蛋白链细胞因子受体亚单位 gpl30作为共同的受体和转导子, CTF1的第二个受体:白血病抑制因子受体亚单位β (L IFRβ),即 gpl90。此外,CTF1还有第三个受体,是相对分子质量 80×103的 CTF1特异受体,类似于CNTF受体成分中的α亚基,其可能与 gpl30和gpl90形成三聚体[3]。CTF1和特异的受体结合后,诱导 gpl30同源二聚体或异源二聚体的形成,从而激活与之结合的胞浆内的酪氨酸激酶,激活 Janus激酶(JAKs)和 gpl30酪氨酸激酶磷酸化,导致多个信号通路的激活[4]。目前已发现 CT-1细胞内信号通路包括 JAK/STAT3,MAPK/ERK和 PI3-K/Akt,其下游介质有多聚 ERK配对转录因子、核因子-3、STAT3和热休克蛋白 (HSP)56、70、90等[5]。

作为一种多效性细胞因子,CTF1在神经系统具有类似于其它神经营养因子的生物学作用。CTF1能维持运动神经元、多巴胺神经元和交感神经元长时间存活,诱导培养交感神经元递质表型的连接[6-8]。而 CNTF仅能保护交感神经元,并不能诱导产生对多巴胺能神经存活的生物学效应,因此CTF1较 IL-6家族其他成员具有更强的神经系统作用。除了对不同神经元的保护效应外,CTF1还能够诱导体外培养的交感神经元的显性转换。这将导致其转化为产生胆碱乙酰基转移酶及血管活性肽的胆碱能显性,同时伴有类似于酪氨酸过氧化物酶的儿茶酚胺酶的遗失[9]。此外,大脑发育过程中星形细胞的分化是通过 CTF1诱导的信号与骨形成蛋白之间的互作来实现的[10]。

鉴于 CTF1在神经系统上的研究日益增多,其对神经系统的影响及其与神经系统相关疾病的关系逐渐被人们所重视。本研究经 CTF1基因插入PDGF B-链启动子下游,通过转基因技术将 CTF1基因转入 C57BL/6J小鼠,建立了神经组织特异表达CTF1的转基因小鼠,并对转基因小鼠的脑组织进行组织学观察分析,为 CTF1在神经系统的生物学功能研究,以及 CTF1对老年痴呆及帕金森等神经系统疾病发病机制的研究提供有价值的模型动物。

1 材料和方法

1.1 CTF1表达载体的构建及转基因

以 pCMV-SPORT6-CTF1质 粒 (Openbiosy ster ms,Clone ID5750481,美国)为模板,通过 PCR扩增获得带有 HindⅢ和 XholⅠ酶切位点的完整的CTF1基 因 (BC064416),上 游 引 物 为:5′-TATAAGCTTCACCATGAGCCGGAGGGAG-3′;下游引物为:5′-AAACTCGAGCAAAGAAGCGGAAGGAGAG ACG-3′(上海生物工程技术有限公司合成,中国)。将 CTF1片段插入 pMD18T载体,经测序并比对正确无突变碱基后,以 HindⅢ和 XholⅠ(宝生物工程有限公司,中国)酶切回收该片段,并克隆入 PDGF B-链启动子(TuckerCollins博士惠赠,哈佛大学医学院)的下游构建神经组织特异表达 CTF1表达载体。提取并酶切鉴定质粒正确后,再用 Tth111Ⅰ和 XbaⅠ (宝生物工程有限公司,中国)将其线性化, Sephedex G50柱纯化DNA片段,获得 PDGF启动的CTF1基因的转基因片段,注射前将其浓度调整至 5 ng/μL,用显微注射法将线性化的转基因载体注射到 C57BL/6J小鼠的受精卵中[小鼠购自中国医学科学院实验动物研究所,康蓝公司。XCXK(京) 2004001],用 I CR小鼠作假孕受体 (本实验室饲养),制备转基因小鼠 (TE2000U显微注射仪)[11]。实验中涉及动物的操作程序已经得到中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会的批准,批准号为 GC05004。

1.2 PCR鉴定 CTF1转基因小鼠的基因型

转基因小鼠在出生 9～14 d用剪趾法标记,收集剪下的组织,用碱裂解法提取基因组 DNA[12],用PCR法对转基因小鼠进行基因型检测。PCR上游引物为:5′-AGCCGGAGGGAGGGAAGTCT-3′,下游引物为:5′-AGAAGCTGGGCAGCCCGAAG-3′(上海生物工程技术有限公司合成,中国)。PCR反应体系20μL(宝生物工程有限公司,中国)。反应条件: 94℃预变性 3 min,94℃变性 30 s,65℃退火 30 s, 72℃延伸 30 s,重复变性到延伸 29次,完成 30个循环。目的基因 CTF1片段为 181 bp。

1.3 W estern Blot鉴定 CTF1的表达

分别提取 2只首建鼠的 F1代阳性转基因小鼠和同龄阴性对照小鼠脑组织总蛋白,进行 SDSPAGE凝胶电泳,蛋白转移至NC膜上(Millopore,美国),置于 5%脱脂奶粉封闭液,羊抗 CTF1抗体检测 CTF1蛋白的表达水平 (Abcam,美国),辣根过氧化物酶 (HRP)-偶联的兔抗羊抗体结合一抗 (Pierce,美国),HRP-偶联的鼠抗β-actin单克隆抗体作为内参(康成生物,中国)。

1.4 组织学观察 CTF1转基因小鼠脑组织

选用 1月龄和 4月龄转基因和同龄阴性对照小鼠,颈椎脱臼法牺牲小鼠,打开颅腔取出完整脑组织,中性福尔马林溶液中固定 24 h,脱水,石蜡包埋,切片,HE染色,显微镜下观察(Nikon显微镜,日本)组织学变化。

2 结果

2.1 CTF1表达载体的构建

用 PCR法克隆的 CTF1基因,测序结果表明克隆的 CTF1基因与已报道 CTF1序列完全一致(GenBank:BC064416.1),将该基因插入神经组织特异表达的 PDGF启动子的下游,构建CTF1转基因表达载体 (图 1)。

2.2 CTF1转基因小鼠的基因型

用显微注射法将线性化的转基因载体注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中,转入到假孕受体 I CR小鼠中,小鼠出生 9～14 d提取基因组DNA,用 PCR扩增CTF1目的基因 181 bp的片段来鉴定CTF1转基因小鼠基因型(图 2),共得到 2只首建鼠,均可传代。

2.3 CTF1基因的表达

分别提取 2个首建鼠的 F1代转基因小鼠和同龄阴性对照小鼠脑组织总蛋白,用 CTF1多克隆抗体进行Western Blot分析,结果显示在相对分子量为 21×103处,6号和 12号转基因阳性小鼠品系脑组织内 CTF1蛋白表达量明显高于同龄阴性对照小鼠(图 3见彩插 4)。

图 1 CTF1转基因表达载体Fig.1 CTF1 transgenic construct

图 2 PCR分析 CTF1转基因小鼠基因型Fig.2 Genotyping CTF1 transgenic mice by PCR注:M:DNA分子量标记;1:阳性对照;2:阴性对照;3:空白对照;6,7,9:F1代阳性转基因小鼠;4,5,8:F1代阴性转基因小鼠

2.4 CTF1转基因小鼠脑组织学改变

将 1月龄和 4月龄的 CTF1转基因小鼠和同龄阴性小鼠的脑组织进行解剖和组织结构形态观察,未发现异常。将脑组织进行 H&E染色,镜下观察, CTF1转基因小鼠与同龄阴性对照小鼠相比较,大脑皮质,深层髓质,软膜,神经胶质细胞及锥体细胞等均未见明显结构形态的改变。小脑分子层、蒲肯野细胞层及颗粒层亦未见明显结构形态的改变 (图 4见彩插 4)。

3 讨论

CTF1属于 IL-6细胞因子家族,存在于多种组织中,由于 IL-6细胞因子家族成员在生物学作用上具有多样性和重叠性的特点,决定了 CTF1对多个系统具有广泛的影响,是一种具有广谱生物学活性的细胞因子,CTF1不仅对心脏产生多种影响[13],在神经系统还具有类似于其它神经营养因子的生物学作用。CTF1能维持运动神经元,多巴胺神经元和交感神经元长时间存活,诱导培养交感神经元递质[7,8,14],然而 CTF1的神经元保护维持作用的具体机制尚不明确[15]。CTF1是为研究心肌肥大作用而克隆出的细胞因子,随后的研究使人们更感兴趣的是 CTF1的心肌保护和神经元保护作用。目前有关CTF1基因结构、受体组成及 CTF1对不同组织细胞的生物学作用的研究已经相继展开。

本文建立的神经组织特异表达 CTF1转基因小鼠,脑组织中 CTF1蛋白表达明显高于对照小鼠,转基因小鼠大、小脑组织结构形态未见明显改变。未来将本文建立的神经组织特异表达 CTF1转基因小鼠与基因突变致早老痴呆转基因小鼠模型杂交,对子代双转基因小鼠模型脑组织病理学改变及相关机制的研究,有望进一步加深 CTF1对神经系统,如在神经元保护及在神经递质的传递等方面的作用机制的理解,同时对临床上包括老年痴呆,帕金森等神经退行性疾病发病机制及治疗方面的深入研究皆具有重要意义。

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The Establishment of CTF1 Gene TransgenicM ice Specifically Expressed in Nervous Tissues

LV Dan,CHENGWei,CAO Xing-shui,ZHANG Xiao-juan,WANG Shu-mei,ZHANGLian-feng
(KeyLaboratory of Human Disease ComparativeMedicine,Ministry of Heath, Institute ofLaboratoryAnimal Science,Chinese Academy ofMedical Sciences& ComparativeMedical Center,PekingUnionMedical College,Beijing 100021,China)

ObjectiveTo generate the CTF1 gene transgenic mice specifically expressed in nervous tissues and to make an animalmodel for the study of its function and effects on Alzheimer’s disease。MethodsTransgenic mice were created by the methods of microinjection.The genotype of transgenic lines was identified by PCR.The brain specific expression of the CTF1 gene was analyzed byWestern Blot.The histological changes of the brain from the transgenic mice were analyzed by microscope observation。ResultsTwo transgenic lines with high level of expression of the CTF1 gene were selected from three transgenic lines.The transgenic mice show no difference compared with wild type by histological detection on brain tissues。Conclusions A CTF1 gene transgenic mice specifically expressed in nervous tissues was established,itwill be an useful animalmodel to study the CTF1 functions on AD.

CTF1;Nervous tissues;Transgene

R349.83

A

1671-7856(2010)01-0028-04

2009-09-09

卫生部行业基金,实验动物和人类疾病动物模型资源扩展(200802036)和十一五新药专项支持(2009ZX09501-026)。

吕丹(1980年 -),女,实习研究员。E-mail:lvdan0707@163.com

张连峰。E-mail:Zhanglf@cnilas.org