猴泡沫病毒(SFV)RT-nestedPCR检测方法的建立及初步应用

栗景蕊,付 瑞,李晓波,贺争鸣

(中国药品生物制品检定所,北京 100050)

技术方法

猴泡沫病毒(SFV)RT-nestedPCR检测方法的建立及初步应用

栗景蕊,付 瑞,李晓波,贺争鸣

(中国药品生物制品检定所,北京 100050)

目的建立实验猴群及相关生物制品猴泡沫病毒(SFV)的 PCR检测方法。方法选择 SFV-1、SFV-3、SFVCPZ前病毒序列的 pol基因同源性较高的区域设计嵌套引物对 SFV-1毒种进行 RT-nestedPCR扩增并克隆测序,以确定其准确性,通过验证方法的特异性和敏感性,初步应用该方法对恒河猴外周血淋巴细胞 (PBLs),常用猴肾传代细胞及猴源性生物制品进行检测。结果经 RT-nestedPCR扩增出的片断与 SFV-1 cDNA序列同源性达到99%,对 10只恒河猴的检测结果为 5只阳性,5只阴性,对常用猴肾传代细胞及脊髓灰质炎疫苗的检测结果均为阴性。结论所建立的 SFV RT-nestedPCR检测方法能准确的检测出恒河猴 SFV的感染情况,对控制实验猴群的质量具有重要意义。该方法可用于检测猴源性生物制品中 SFV的污染情况,为保证生物制品应用的安全性提供一定依据。

猴泡沫病毒;逆转录-巢式 PCR;外周血淋巴细胞

猴泡沫病毒 (SFV)属于反转录病毒科,泡沫反转录病毒亚科。Wolfe等[1]在喀麦隆村民中检出SFV抗体,并证明 SFV可传染给人。美国华盛顿大学国家灵长类动物研究中心等机构的研究人员[2]在印尼巴厘岛发现亚洲首例 SFV,并发现其自然宿主是非人灵长类动物如恒河猴和黑猩猩。猴可终生无症状携带 SFV,人类则可诱导中枢神经的退行性疾病[3]。SFV与 S IV的结构极为相似,国外有报道称泡沫病毒(FV)可加剧艾滋病 (A IDS)的进行性发展,可能的机理是泡沫病毒(FV)可通过激活免疫缺陷病毒基因的表达而致病[4]。猴是常用的模式动物,目前很多疫苗类生物制品需用猴的组织,如恒河猴肾细胞(RMK)用作脊髓灰质炎减毒活疫苗生产的细胞基质,非洲绿猴肾细胞 (Vero)用作狂犬疫苗生产的细胞基质,而猴群中 SFV感染率高达 70%,为了保证猴群质量,防止 SFV在人群中传播,建立有效的 SFV检测方法势在必行。WHO第 49次生物标准化专家委员会会议对脊髓灰质炎疫苗规程作出明确补充,指出用于疫苗生产的猴肾细胞应是来自隔离猴群泡沫病毒抗体阴性的猴体。因此,建立灵敏准确的 SFV检测方法对于监测猴群 SFV的感染情况,保证生物制品生产用猴的质量意义重大。我们建立的 RT-nestPCR法能够快速、准确的检测猴群中 SFV的感染情况,同时也为生物制品安全性控制提供依据。

1 材料和方法

1.1 毒种和培养细胞

SFV-1株,购自美国 ATCC,编号:VR-276。培养细胞为幼仓鼠肾传代细胞 (BHK-21),本室保存。

1.2 病毒培养及细胞病变观察

将 SFV-1株接种BHK-21细胞并进行连续传代培养,观察细胞病变 (Cytopathogenic effect,CPE)[5],同时测定 TC ID50。

1.3 引物设计与合成

分析已报道的猴泡沫病毒基因组序列,选择SFV-1、SFV-3、SFVCPZ前病毒序列的 pol基因同源性较高的区域设计嵌套引物 (图 1),该区域高度保守,与同科病毒进行序列比对,特异性较好。引物序列见图 1,由上海英潍捷基贸易有限公司合成,第二轮扩增产物大小为 410 bp。

图 1 嵌套引物序列及在 SFV-基因组的位置Fig.1 Schematic representation of the SFV-1 genome indicating the position of the pr imer pairs

1.4 主要试剂及仪器

AMV RTase,随机引物均购自 Promega公司,LA Taq DNA聚合酶,dNTP Mixture和 100 bp DNA ladder均购自 Takara公司。PCR仪和电泳仪,均购自B IO-RAD公司。

1.5 总RNA提取

采用 Invitrogen公司的 TR Izol Reagent一步法从细胞培养液或组织中提取 RNA,详细操作步骤见说明书。

1.6 猴外周血淋巴细胞的分离

静脉抽取猴外周血 1.5 mL,EDTA抗凝,用 Ficoll法分离淋巴细胞,分离步骤详见说明书,最后PBS洗两遍备用。

1.7 反转录与 nestPCR过程

通过优化反应条件及体系浓度,确定 RT-nestPCR检测方法。

1.8 PCR产物的检测

取 5μL扩增产物于 1.5%琼脂糖凝胶 (含 0.5 μg/mL溴乙锭)进行电泳鉴定。电泳缓冲液为 1× TAE(0.04 mol/L Tris乙酸,0.001 mol/L EDTA, pH8.0),120 V电泳 30 min,在紫外成像仪下观察PCR产物条带在凝胶中的位置,以 100 bp DNAladder为参照物,判定结果。将 RT-nestPCR阳性扩增片段进行克隆测序,通过与 SFV序列进行比对以确定 PCR扩增的准确性。

1.9 RT-nestPCR方法特异性的测定

应用所建立的 RT-nestPCR方法同时检测猴泡沫病毒BHK-21细胞培养液、小鼠淋巴细胞白血病病毒(MuLV)、人类免疫缺陷病毒 (H IV)、麻疹腮腺炎联合减毒活疫苗及正常BHK-21细胞培养液以测定其特异性;将 RT-nestPCR阳性扩增片段进行克隆测序,以进一步验证方法的特异性。

1.10 RT-nestPCR方法敏感性的测定

取 TC ID50值为 5.25的病毒液,用 PBS做倍比稀释,分设 10-1到 10-9九个稀释度。取每个稀释度病毒液各 0.5 mL制备模板进行 RT-nestPCR扩增,扩增产物经 1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定,判断所能扩增的最小病毒滴度;将起始浓度为 26.17μg/mL的 RNA样本做倍比稀释,分设 10-1到 10-9九个浓度梯度进行 RT-nestPCR扩增,扩增产物经 1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定,判断所能扩增的最小 RNA模板浓度。

1.11 检品来源

在方法的初步应用中,所检测的猴抗凝血均采自北京协尔鑫生物资源研究所饲养的 10只恒河猴,所检测的两批口服脊髓灰质炎减毒活疫苗由中国医学科学院昆明生物所生产,批号为 2007120227和2007120118;所检测的五种常用的猴肾传代细胞MA104、Vero-E6、MK2、MEK、Vero均为本室保存。

2 结果

2.1 培养细胞的病变及 TC I D50的测定

SFV-1接种BHK-21细胞后 3 d呈现出明显的细胞病变 (图 2见彩插 3),使 BHK-21细胞圆缩脱落,经测定感染滴度为 105.25TC ID50/0.1 mL。

2.2 检测方法的建立

用 TR Izol Reagent一步法从 SFV BHK-21细胞培养液中提取 RNA后,对反转录体系和 nestPCR体系及条件分别进行了优化,确定了如下体外扩增方案:反转录体系总体积 25μL,其中无 Rnase水 7μL,5×反转录酶缓冲液 5μL,dNTPmix(2.5 mmol/L each)4 μL,随机引物0.5μL,RNA模板8μL,AMV反转录酶(10 U/μL)0.5μL,反应条件为 37℃90 min,72℃15 min,4℃5 min。将产物 cDNA冻存于 -20℃备用; nestPCR体系第一次扩增总体积为 25μL,包括 ddH2O 13.25μL,10×LA反应缓冲液 2.5μL,Mg2+(25 mmol/L)2μL,dNTPmix(2.5 mmol/L each)3μL,上下游引物各1μL,cDNA模板 2μL,LA-TaqDNA聚合酶(2.5 U/μL)0.25μL。第一次扩增使用 P1、P2引物,反应条件为94℃预变性5min;94℃1min,50℃1 min,72℃1 min,共 35个循环;72℃再延伸 10 min,最后 4℃5 min。第二次扩增总体积为 25μL,其中, ddH2O 12.75μL,10×LA反应缓冲液 2.5μL,Mg2+(25 mmol/L)2.5μL,dNTPmix(2.5 mmol/L each)3 μL,上下游引物各 1μL,LA-TaqDNA聚合酶(2.5 U/ μL)0.25μL,第一次扩增后从扩增产物中取 2μL作为第二次扩增的模板,用 P3、P4引物进行第二次扩增。反应条件为 94℃预变性 5 min;94℃ 1 min, 53.8℃1 min,72℃1 min,共 40个循环;72℃再延伸10 min,最后 4℃5 min。

2.3 检测方法的特异性

用所建立的 RT-nestPCR方法检测猴泡沫病毒BHK-21细胞培养液为阳性结果,检测小鼠淋巴细胞白血病病毒(MuLV)、人类免疫缺陷病毒(H IV)、麻疹腮腺炎联合减毒活疫苗及正常BHK-21细胞培养液均为阴性(图 3)。将阳性扩增片断进行克隆测序,测序结果经BLAST分析,与 GenBank中 SFV-1核酸序列同源性为 99%(图 4),说明该方法特异性较好。

图 3 RT-nestPCR检测 SFV的特异性测定Fig.3 Specificity of detection of SFV by RT-nestPCR

图4 SFV-1测序BLAST分析比对Fig.4 Blast of SFV-1 measured sequence in GeneBank

2.4 检测方法的敏感性

取感染滴度为 105.25TC ID50/0.1 mL的病毒液,用 PBS做 10倍稀释,取每个稀释度病毒液各 0.5 mL制备模板进行 RT-nestPCR扩增。结果显示可检测到稀释度为 10-3的病毒核酸 (图 5);将起始浓度为 26.17μg/mL的 RNA样本做 10倍稀释并进行RT-nestPCR扩增,结果显示能够检测到的最小 RNA稀释度为 10-5,即所能扩增的最小 RNA模板浓度为 0.26 pg/μL(图 6)。

2.5 初步应用

2.5.1 猴组织样品的的检测:采北京协尔鑫生物资源研究所 10只恒河猴的外周血,用 Ficoll法分离淋巴细胞,提取RNA,经RT-nestPCR检测,有5只恒河猴出现阳性条带 (图 7),经测序M4与 SFV-1序列同源性为 98%,与 SFV-3序列同源性为 86%;M5与SFV-1序列同源性达到 99%,与 SFV-2序列同源性达到 97%,证明了检测方法的准确性,同时也说明所建立的 RT-nestPCR方法能够同时检测出不同型别的 SFV。

2.5.2 常用猴肾传代细胞的检测:取MA104、Vero-E6、MK2、MEK、Vero五种常用的猴肾传代细胞分别提取 RNA,经 RT-nestPCR检测,五种细胞均未检出SFV病毒核酸序列(图 8)。

图 5 RT-nestPCR检测 SFV的敏感性测定——病毒液浓度梯度Fig.5 Sensitivity of detection of SFV by RT-nestPCR—concentration gradient of virus

图 6 RT-nestPCR检测 SFV的敏感性测定——RNA模板浓度梯度Fig.6 Sensitivity of detection of SFV by RT-nestPCR—concentration gradient of RNA

图 8 常用猴肾传代细胞及猴源性生物制品的检测Fig.8 Detection of SFV by RT-nestPCR in passage monkey kidney cells and its related biological products

2.5.3 猴源性生物制品的检测:取中国医学科学院昆明生物所生产的两批口服脊髓灰质炎减毒活疫苗分别提取 RNA,经 RT-nestPCR检测,均未检出 SFV核酸序列 (图 8)。

3 讨论

图 7 RT-nestPCR检测恒河猴外周血 SFVFig.7 Detection of SFV by RT-nestPCR in PBLs of rhesusmonkey

PCR技术由于其快速、安全且具有较高敏感性和特异性等优点被广泛应用。目前,国内 SFV的检测主要采用 Kupiec等建立的 nest-PCR方法[6,7]。该方法针对不同型别的 SFV设计了不同的引物进行 PCR检测,在应用于实验猴群的检测时,程序较为复杂,不适用于批量检测。我们所建立的 RT-nestPCR方法针对不同型别 SFV的 pol基因同源性较高的区域设计引物,理论上可以同时检测 SFV-1, SFV-2,SFV-3及 SFVcpz等不同型别的 SFV,经初步应用于恒河猴的检测证实了所建立的 RT-nestPCR方法能够同时检测出不同型别的 SFV,可用于对实验猴群 SFV感染的筛查,提高了检测效率。实验结果表明,该方法具有良好的特异性,检测与 SFV相似的病毒如MuLV,H IV,麻疹腮腺炎病毒均为阴性,无交叉反应出现,所扩增片段经测序与 GenBank数据库中报道的 SFV序列同源性达到 99%,同时也说明该方法的准确性高。此外,nest-PCR经过两次扩增大大提高了检测方法的敏感性,可以从感染滴度为 105.25TC ID50/0.1 mL的病毒中检测到稀释度为10-3的病毒核酸。

Lear的研究表明咽头上皮、淋巴细胞是 SFV的主要富集处[8]。分离猴外周血淋巴细胞,应用 RT-nestPCR方法检测实验猴群 SFV感染情况,具有采样方便,快速简便等优势。本实验中从 10只恒河猴中检出 5只 SFV阳性个体,与猴群中 SFV的高感染率较为一致。应用所建立的 RT-nestPCR方法对常用猴肾传代细胞及猴源性生物制品进行检测,均未检测到 SFV核酸序列,初步说明目前常用的猴肾传代细胞以及猴源性生物制品污染 SFV的几率较小或生产过程中病毒灭活效果较好。

由于 SFV经常呈低水平感染或持续感染状态, SFV抗体的血清学检测方法难以完全反映猴群 SFV带毒状况。加强实验用猴和猴源性生物制品的病毒检测不仅可以保证疫苗等生物制品的安全性,同时也减少了人类的逆转录病毒感染率。我们所建立的检测 SFV核酸的 RT-nestPCR方法具有快速、准确、特异、敏感等优点,可以为猴群的带毒状况提供一个可靠的诊断方法,也适用于猴源性生物制品 SFV的检测,对于控制 SFV传播和人民用药安全意义重大。

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Establishment and Application of Assay for the Detection of SFV by Reverse Transcription-nested Polymerase Cha in Reaction

L IJing-rui,FU Rui,L IXiao-bo,HE Zheng-ming
(National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products,Beijing 100050,China)

ObjectiveTo establish PCR testingmethod thatmonitor simian foamy virus in laboratorymonkeys and related biological products。MethodsDesigned two series pr imers of nested PCR according to the region which has high homology among SFV-1,SFV-3,SFVCPZin pol gene of SFV proviral DNA,then cloned and measured sequence for SFV-1 strain after RT-nestedPCR to determine its accuracy.After tested its specificity and sensitivity,to test peripheral blood lymphocytes of rhesusmonkey,passage monkey kidney cells and its related biological products by RT-nestedPCR method. Results Itwas 99%homology between the target segment by RT-nestedPCR and SFV cDNA in GeneBank,the testing result of peripheral blood lymphocytes of rhesus monkey by RT-nestedPCR were 5 positive and 5 negative,the testing results of passage monkey kidney cells and poliomyelitis vaccine were negative。ConclusionThis method is efficient to detect SFV in rhesusmonkey,and it has great significance for quality control of laboratorymonkeys.It also can be used to test SFV in related biological products,and provide some evidence to guarantee the security of biological products.

Simian foamy virus;RT-nestedPCR;Peripheral blood lymphocytes

Q939.47

B

1671-7856(2010)01-0046-06

2009-08-18

栗景蕊(1983-),女,硕士,研究方向:实验动物病毒学。

贺争鸣(1957-),男,研究员,博士,研究方向:实验动物微生物学。E-mail:zhengminghe57@163.com