高脂膳食对小鼠生化及病理形态的影响

白慧称,李 军,刘敬浩,田永路,朱德生

(北京大学实验动物中心,北京 100871)

研究报告

高脂膳食对小鼠生化及病理形态的影响

白慧称,李 军,刘敬浩,田永路,朱德生

(北京大学实验动物中心,北京 100871)

目的高脂膳食对机体血液、组织匀浆中各种生化指标的影响,尤其是对胆固醇等脂质代谢的影响,为研究高胆固醇引起的心血管等疾病建立模型。方法将 C57BL/6j小鼠 63只随机分为 2组。普食组(用普通饲料饲喂)12只,雌雄各 6只,高脂组 (用高脂饲料饲喂)51只,雌 26只、雄 25只。单笼饲喂,饲喂期为 67 d。观察动物体重、摄食量、比较血液以及肝、肾组织匀浆中有关脂类代谢和抗氧化方面的生化指标以及组织病理学观察。结果高脂组血液中胆固醇(TC)和低密度脂蛋白胆固醇(LDLC)均显著高于普食组 (P<0.05);高脂组肝、肾脏组织匀浆中 T-AOC、CuZn-SOD、SOD、AKP、NOS、MDA的水平与普食组相比均无统计学差异;与普食组相比,雄性小鼠摄食量差异显著(P<0.05)、体重差异不显著;病理观察可见高脂组中肝细胞空泡变性。结论通过高脂膳食成功的建立了高胆固醇血症模型,该模型有可能在胆固醇浓度升高引起的脂质代谢异常、动脉粥样硬化、冠心病和其他代谢性疾病的研究中发挥作用。

高脂膳食;胆固醇;血液生化;组织匀浆

随着饮食中的胆固醇含量不断增加,人患心脏病和中风的几率越来越高。亚太心血管疾病和中风调查显示,亚洲人体内的胆固醇每增加一单位 (1 mmol/L),心血管疾病死亡危险几率就增加35%,和血管有关的中风几率也会增加 25%。我国大约有心血管疾病患者 1300多万,并且每年以 10%的发病率增长,我国心血管疾病的发病率:高血压为18.8%、冠心病为 10%、先心病为 3%、风心病为1%、急性心肌梗死为 15.4/10万,流行病学调查显示,心血管疾病的发病率急剧上升,并呈年轻化趋势[1]。心血管疾病的发病因素复杂,和基因、饮食、环境以及社会因素均有一定的关系,尤其是饮食因素,高脂肪膳食导致了一系列的改变,比如导致血中胆固醇升高,从而产生多种不易被人察觉的、缓慢进行性的危害,可以说,高胆固醇血症是一种潜伏的健康“杀手”。脂质代谢紊乱特别是血浆胆固醇浓度升高可导致并加速动脉粥样硬化的进展,使冠心病和血栓形成性疾病容易发生。血浆 TC水平增高,冠心病危险性增高;LDLC水平也与冠心病发病率呈正相关[2,3]。有研究表明,胆固醇和阿尔茨海默病 (AD)之间存在着重要的联系[4,5]。如果在动物上复制出人类高脂膳食类似的改变,对研究高脂膳食的致病机理,控制高脂膳食导致的病理变化将非常有帮助[6]。

本实验中用高脂膳食饲喂小鼠,观察生化、形态学改变,希望在动物体内观察到人类高脂膳食类似的改变,为研究高脂饮食相关疾病,如动脉粥样硬化、心血管病以及代谢性疾病提供合适的动物模型。

1 材料和方法

1.1 试剂

试剂:超氧化物岐化酶 (SOD)测试盒 (包含SOD和铜锌超氧化物岐化酶 CuZn-SOD)、总抗氧化能力(T-AOC)测试盒、一氧化氮合酶(NOS)测定试剂盒、丙二醛(MDA)测定试剂盒 (南京建成),低密度脂蛋白胆固醇试剂盒 LDLC、高密度脂蛋白胆固醇试剂盒 HDLC、甘油三酯试剂盒-TG(北京北化康泰临床试剂有限公司),总胆固醇 (TC)试剂盒 (上海申索佑福医学诊断用品有限公司)均为商业化的产品。

1.2 动物的选择

供试动物 C57BL/6J小鼠 63只、雌雄各半,4周龄,小鼠体重:雌性 (13.18±1.08)g;雄性 (14.76± 1.12)g;SPF级,来源于军事医学科学院实验动物中心[SCXK-(军)2007-004]。

1.3 饲料

普通饲料配方:每 100 g饲料中能量的比值:糖50.04%、蛋白质 14.70%、脂肪能 35.26%,其他成分的含量:磷酸氢钙 1%、碳酸钙 1.3%、赖氨酸0.12%、蛋氨酸 0.3%、氯化胆碱 0.1%、矿物元素添加剂 0.04%、食盐 0.2%、维生素添加剂 0.02%。

高脂饲料配方:每 100 g饲料中能量的比值:糖35.15%、蛋白质 14.42%、脂肪能 50.43%,其他成分的含量:磷酸氢钙 1%、碳酸钙 1.1%、赖氨酸0.12%、蛋氨酸 0.3%、氯化胆碱 0.1%、矿物元素添加剂 0.04%、食盐 0.2%、维生素添加剂 0.02%。

上述饲料由军事医学科学院实验动物中心加工制作,塑料袋密封包装,于 4℃冰箱保存。

1.4 动物饲养

动物饲养于北京大学 SPF级动物房,12 h明暗交替,单笼饲养,自由采食。

1.5 动物及其处置

将C57BL/6J小鼠63只随机分为2组。普食组12只,雌雄各 6只,高脂组 51只,雌26只、雄 25只。分别饲喂普通饲料和高脂饲料,饲喂期为 67 d。试验过程中观察并记录每组 C57BL/6J小鼠的摄食量和体重。饲喂结束后,小鼠禁食 12 h、正常饮水,采用眼静脉丛采血并处死动物,制备血清;将肝脏和肾脏加入预冷的 0.1 mol/L的硼酸缓冲液(pH 8.3)研磨 (脏器∶缓冲液 =1∶5),制备组织匀浆,4℃10000 r/min离心 20 min,取上清,-20℃保存备测。

1.6 测定指标

1.6.1 一般观察:对各组小鼠的体重、摄食量进行动态检测,每周测定 1次。

1.6.2 血液生化指标:试验结束后禁食 12 h,在眼底静脉丛采血,测定血清 SOD、MDA、NOS、TC、HDL-C、LDL-C、TG浓度。

1.6.3 肝脏、肾脏组织匀浆指标:测定 T-AOC、CuZn-SOD、SOD、AKP、NOS、MDA含量。

1.6.4 病理检查:取肝、肾、胸主动脉、大脑、心脏,经 10%的福尔马林溶液固定,做常规脱水、包埋,进行 HE染色,普通光学显微镜进行观察。

1.6.5 数据分析:利用 SPSS15.0软件进行组间差异的比较,采用的是独立样本的 t检验(Independent-SampletTest)结果以±s表示。

2 结果

2.1 一般观察

高脂组与普食组中雌雄性小鼠的体重均无统计学差异(P>0.05),(图 1)。

每周中平均每天摄食量中高脂组与普食组相比雄性小鼠在 2～ 4周 (P <0.05)、6周 (P < 0.01)、7～8周(P<0.05)差异均显著,部分结果见表 1和图 2。

图1 体重生长曲线Fig.1 The growth curve ofweight in male and female animals of different groups

图 2 摄食量的变化Fig.2 Changes of food intake in male and female animals of different groups

表 1 摄食量的变化Tab.1 Change of food intake

2.2 血液生化指标

高脂组与普食组相比血清中 TC和LDLC的水平有显著性差异 (P<0.05),而 HDLC、SOD、MDA、NOS、TG均无统计学差异。部分结果见表 2。

2.3 肝脏组织匀浆指标

高脂组与普食组相比肝脏组织匀浆中 T-AOC、 CuZn-SOD、SOD、AKP、NOS、MDA均无统计学差异(表 3)。

2.4 肾脏组织匀浆指标

高脂组与普食组小鼠相比肾脏组织匀浆中 TAOC、CuZn-SOD、SOD、AKP、NOS、MDA无统计学差异。部分结果见表 4。

表2 组间动物血清 TC、TG、HDLC、LDLC、SOD、NOS、MDA比较Tab.2 Comparison of serum TC,TG,HDLC,LDLC,SOD,NOS,MDA level between standard chow diet group and high-fat diet group

表3 组间动物肝脏组织匀浆中 T-AOC、MDA、CuZn-SOD、NOS、AKP、SOD比较Tab.3 Comparison of T-AOC,MDA,CuZn-SOD,NOS,AKP,SOD level in Homogenized liver tissue be tween standard chow diet group and high-fat diet group

表4 组间动物肾脏组织匀浆中 T-AOC、MDA、CuZn-SOD、NOS、AKP、SOD比较Tab.4 T-AOC,MDA,CuZn-SOD,NOS,AKP,SOD level in homogenized kidney tissue of standard chow dietmice and high-fat dietmice

2.5 病理检查

病理学检查,仅在肝脏组织观察到形态学改变,其余脏器未观察到明显的异常改变。高脂组肝脏在实质内可见肝细胞内大泡性空泡变性 (图 3见彩插 3)。

3 讨论

每周中平均每天摄食量中高脂组与普食组相比雄性小鼠在 2～ 4周 (P <0.05)、6周 (P < 0.01)、7～8周(P<0.05)均出现显著性差异;高脂组摄食量明显低于对照组。我们推测,可能是高脂膳食的适口性差[7];高脂组与普食组中雌、雄性的小鼠体重均无统计学差异(P>0.05),这可能是由于高脂饲料提供了更多的能量 (每 100 g普通饲料的总能量 209.17 KJ,每 100 g高脂饲料的总能量222.29 KJ)。

血液生化指标中,高脂组与普食组相比血清中TC和LDLC的水平有显著性差异,而 HDLC、SOD、MDA、NOS、TG均无统计学差异。肝、肾脏组织匀浆指标中,高脂组与普食组相比肝、肾脏组织匀浆中T-AOC、CuZn-SOD、SOD、AKP、NOS、MDA均无统计学差异,这些指标未检测出统计学差异,高脂组小鼠肝脏中可见脂肪空泡,提示高脂饮食导致了肝内脂质代谢异常。

曹亚军等[8]也利用高脂膳食诱导大鼠高脂,其结果显示,高脂模型组的血清 TC、TG、LDLC、MDA明显升高,与之相比本实验只检测出 TC、LDLC明显升高,并未检测出 TG和MDA明显升高。导致本实验和上述实验差异的原因有:1)两实验中高脂饲料中各种物质成分的差异;2)大、小鼠对高脂食物敏感性差异。

动物的衰老是一种缓慢的退行性变化,这是因为动物体内有多种抗氧化物和酶,能直接清除活性氧等有害物质,修复、降解细胞内受损的脂类、蛋白质、核酸等生物分子的大部分破损成分,能将未破损的成分区分和储存起来,以便重复利用。正是由于动物体内存在这种高效的损伤代谢防御系统,机体能够成功地克服生理和病理的变化或损伤[9]。本研究中高脂组肝脏、肾脏中未检测出MDA的有明显升高,此现象可能与动物体内高效的损伤代谢防御系统作用有关,机体能够成功地克服这种损伤性改变,处于代偿期,因而肝脏、肾脏中MDA水平可以保持相对稳定。

实验中高脂组血清中MDA虽未有明显升高差异,但可以看出有升高的趋势,MDA的代谢途径是由血液流向肝脏,再由肝脏流向机体其他组织 (包括脑组织)。肝脏的解毒功能是有限的,当血液中大量的MDA达到肝脏不能完全清除的时候,长期的过量的MDA引起疾病、亚健康以至机体老化,产生不良的生物学影响[10]。

血清胆固醇含量和心血管疾病关系已经得到公认。和许多慢性老年性疾病的关系也非常密切。阿尔茨海默病的一个共同特点是β-淀粉样蛋白在特定脑区域的不正常的聚集。研究显示,血液中胆固醇总量及神经元内胆固醇的分布均能影响β-淀粉样蛋白的生物合成,升高的胆固醇水平可以增加细胞内和大多数阿尔茨海默病动物模型中β-淀粉样蛋白的含量,而抑制胆固醇合成的药物可降低这些模型中β-淀粉样蛋白的含量[11]。

目前,利用高脂饲料的动物模型,进行了许多抗血脂药物的药效学评价,例如山楂所含的黄酮能抑制3羟基 3甲基戊二酰辅酶 A(HMGCoA)还原酶的活性,从而抑制内源性胆固醇的合成,并能升高HDLC,降低 LDLC水平[12]。苦豆子生物碱能显著降低血浆 TC,升高 HDLC水平,降低血液黏度[13];复方苦豆子颗粒能明显降低血清及肝脏 MDA的含量[8]。

本实验中高脂组成功的诱导了 TC、LDLC含量明显升高,建立了高胆固醇血症模型,对研究高脂血症相关的老年性疾病、心血管疾病以及对降脂类药物的研究和开发具有重要作用 。

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Effect of High FatD iet on M ice:Chem ical andM orphological Studies

BA IHui-chen,L IJun,L IU Jing-hao,T IAN Yong-lu,ZHU De-sheng
(LaboratoryAnimal Center PKU,Beijing 100871,China)

ObjectiveTo study effect of high fat diet on serum chemistry and homogenized tissue chemistry on mice,and to construct the an imalmodel for human coronary artery disease orothermetabolis m syndrome。MethodsTotal 63 C57BL/6jmice were randomly divided to 2 groups,feed high fat diet and standard chow diet for 67 days respectively, the bodyweight,food intake,serum and homogenized tissue chemistry,morphological characteristic was studied。ResultsMice feeding high diet showed improved total cholesterol and low density lipoprotein cholesterol,and fat degeneration of hepatocytes。ConclusionThe animalmodel of high choleserol in serum was successfully constructed and can be used in studying of lipid metabolism,arteriosclerosis and othermetabolic syndrome.

High fat diet;Cholesterol;Serum chemistry;Homogenized tissue

R151.4+1

A

1671-7856(2010)01-0041-05

2009-09-14

白慧称(1986-),女,研究方向:实验动物。E-mail:baihuichen111@yahoo.com.cn

朱德生(1960-),男,副教授,研究方向:实验动物管理。E-mail:lac@pku.edu.cn