大肠埃希菌外排泵AcrAB-TolC研究相关进展

王 旭综述,黄永茂审校

(泸州医学院附属医院感染科,四川泸州646000)

大肠埃希菌外排泵AcrAB-TolC研究相关进展

王 旭综述,黄永茂审校

(泸州医学院附属医院感染科,四川泸州646000)

大肠埃希菌;耐药;外排泵

细菌的外排系统是一种非特异性耐药机制,是通过细菌外排泵将进入菌体内的药物或其他底物排出膜外,它可以泵出多种对其自身有害的物质,包括喹诺酮类、氯霉素、红霉素、四环素、青霉素、利福平等多种抗菌药物、染料和去污剂等,从而加强细菌在药物选择压力下的生存能力。目前,已在不同细菌上发现几十种外排泵,依据氨基酸序列的同源性,将与抗菌药物相关的膜外排泵分子分为5个主要超家族[1],包括主要易化子超家族(major facilitato r superfamily,M FS)、A TP结合盒(A TP binding cassette,ABC)超家族、耐药节结化细胞分化(resistance nodulation division,RND)超家族、小多重耐药性(smallmultidrug resistance,SMR)家族、多药和有毒化合物排出(multidrug and toxic compound extrusion,MA TE)家族。按能量来源不同可分为两大类:ABC型多药外排系统和次级多药外排系统。大多数抗菌药物的外排系统都属于次级外排系统,多数细菌通过质子驱动力来表达对不同结构化合物的耐药。

1980年Bah和M cM urry在研究大肠埃希菌对四环素的耐药性时发现了主动外排耐药机制,此后人们对细菌特别是大肠埃希菌的外排耐药系统有了进一步的认识。大肠埃希菌是已发现的主动外排泵最多的一种细菌,存在Bcr、Em rE、EmrAB、Em rD、QacE、AcrAB-TolC、AcrEF、AcrD、YdhV、M dfA等多种外排泵。RND中的AcrAB-TolC蛋白是大肠埃希菌多药耐药外排系统中目前研究比较清楚的一种细菌外排泵。用基因敲除技术人工去除AcrAB或TolC基因后,大肠埃希菌对上述药物的敏感性明显增加[2]。

1 外排泵AcrAB-TolC的结构和功能

AcrAB-TolC系统主要有3个部分:膜融合蛋白(AcrA)、外排转运蛋白(AcrB)和外膜通道蛋白(TolC)。AcrA、AcrB、TolC以三聚体形式存在于大肠埃希菌细胞膜上,其中AcrA位于周质间隙中,两端连接着AcrB和TolC;AcrB和TolC分别位于细胞内膜和外膜上。迄今所知,AcrAB-TolC系统可以提供2种途径对药物实现外排,一种是捕获胞质内的药物,直接穿越双层膜将药物排出,比如该系统介导对氯霉素和四环素等膜渗透性药物的耐药;另一种是捕获周质间隙中的药物分子,通过TolC将药物转运到外界[2]。

1.1 AcrA蛋白 AcrA是一个由398个氨基酸残基组成的蛋白质,相对分子质量为41 kD,属膜融合蛋白(membranefusion p rotein,M FP)超家族成员,其脂质化的N端锚钉在内膜上,C端伸展到周质[3]。在周质中,AcrA呈高度不对称,蛋白质的N端和C端不相互接触,而是分别位于两端,从而连接AcrB和TolC形成复合物[4]。AcrA和AcrB位于同一操纵子,两基因之间无终止信号。在大肠埃希菌中除AcrB外,AcrA可以与AcrD、AcrF和YhiV等多个RND家族蛋白作用。AcrA的C端区域290～357的氨基酸残基对于它和AcrB间作用是必须的,这段区域的局部序列特征对决定AcrA与AcrB的作用非常重要[4]。AcrA除了作为桥梁连接AcrB和TolC外,也可以有效激活AcrB。Lobedanz等[4]发现,取代AcrA的357～397氨基酸残基的编码序列,仍然能够产生一种功能性蛋白,但并不能使外排功能完全丧失,从而证实AcrA的290～357残基区域在AcrB的激活。

1.2 AcrB蛋白 AcrB由1 048个氨基酸残基组成,相对分子质量为110 kD,属RND家族。AcrB包括12个亲脂区和2个亲水片段;2个亲水片段是AcrB转运子所特有。射线衍射分析显示,AcrB以同三聚体形式横跨细胞内膜,在内膜的外侧形成漏斗形结构,开口于细胞周质,能直接摄取细胞周质间隙中的药物,在内膜的内侧形成一个直径为30Å的中央腔,开口向细胞质,漏斗形结构和中央腔相连的部分是个狭窄或关闭的孔道[5]。在对AcrB氨基酸残基的分析中,研究人员发现了与底物结合以及质子转移供能相关的位点。在T(tight)状态时, AcrB 2个周质结构域上的F136、178、610、615、617和628; V 139、612;I277、626和位于孔洞结构域的Y327构成的疏水区域,一些化学性质不同的物质如罗丹明6G和溴化乙锭(ethidium bromide)等可以进入结合洞穴,通过疏水键与中央洞穴结合[6]。

1.3 TolC蛋白 TolC由495个氨基酸组成的三聚体,上端为开放结构,以便给外排底物提供泵出宽阔通道;下端为封闭结构,其中包括一个10 nm的位于细胞周质的一个螺旋孔道和一个4 nm跨越外膜的筒状结构。它是一个由TolC基因编码的多功能的TolC,可以与多种不同的转运蛋白相耦合,在转运过程中几乎不决定转运的特异性和方向[7]。TolC为三聚体,蛋白质一部分以螺旋结构进入周质与AcrA连接,当内膜AcrB捕获到细胞内的有害物质并与之结合时,TolC与AcrAB复合体连接,打开内在通道,将有害物质排出。基因研究证实, TolC是AcrAB实现其功能不可或缺的部分,TolC的作用主要是为药物分子通过细菌外膜提供途径(图1)。

图1 大肠埃希菌外排泵AcrAB-TolC结构和功能示意图

2 AcrAB-TolC的基因调控

AcrAB的表达受多种调控因子的调节,包括局部和全局两个层次调控。局部调控常常是在紧邻其基因的位置上表达出转录抑制或激活蛋白,以调控该泵蛋白的表达。大肠埃希菌多药外排泵AcrAB-TolC系统中,AcrA和AcrB蛋白的基因位于同一个操纵元上,AcrA上游存在着一个调控基因,AcrA属于局部调控基因[8-10]。全局性的调控则往往是由细胞内一些整体性调控因子参加的与细胞整体代谢变化相关联的调控机制。

2.1 局部调控因子 局部调控因子AcrR位于转运子基因上游,其编码产物为N末端含有超螺旋结构阻遏调控蛋白。AcrR为负调控蛋白,AcrR作用可以阻遏AcrAB的外排作用,其基因突变可以使AcrAB表达增强,同时AcrR也可以抑制自身的启动子而调控自己的表达,从而使耐药性增强[11]。Webber等[10]对于不同来源的抗氟喹诺(nuoroquinolone)大肠埃希菌突变型进行分析发现,它们的AcrB过量表达并且AcrR第45位氨基酸有突变,利用野生型AcrR对此种突变型进行互补实验发现,互补会导致菌株对环丙沙星(cip rofloxacin)和溴化乙锭敏感性增加。在人工突变研究中,Ma将大肠埃希菌Ac-rR插入失活后,AcrAB的转录水平随之提高;将AcrR连接到pACYC177上让其过量表达,会抑制AcrAB的转录。

2.2 整体调控因子 整体调控因子负责诱导这个外排泵系统,增加AcrAB和TolC的转录,属于正调控。目前发现,参与正调控的因子有MarA、Rob、SoxS和Fis等[12]。

2.2.1 全局性调控蛋白(MarA) MarA是多重抗菌药物耐性(multiple antibio tic resistance,M ar)操纵元的转录激活蛋白,由125个氨基酸组成的正调控因子。它可结合到AcrAB启动子附近,增强RNA聚合酶与该启动子的亲合力,促进AcrAB的转录,它也能以同样的方式提高TolC的表达。MarA亦可提高自身的转录水平,MarA作为一个单体可与MarRAB启动子上方MarO连结,激活MarRAB的转录,提高MarA在细胞内的表达量,随后与MarA调节基因启动子邻近的AcrAB和TolC结合,促进其转录[13]。

2.2.2 其他正调控蛋白(SoxS) SoxS是整体超氧化反应(superoxide response,SOX)调控元SoxRS的效应蛋白,是由107个氨基酸组成的小分子蛋白质。蛋白组学和遗传学常规分析结果显示SoxS可激活17个基因或操纵子的表达,过氧化物(O2-)可以使SoxR效应蛋白转变成它的活化形式(SoxR＊),活化的SoxR进而会促进SoxS的产生[13];Rob是由289个氨基酸组成的能结合低分子量效应基因单独区域的较大蛋白质,大肠埃希菌中Rob的无意义突变可增加其对有机溶剂的敏感性,过量表达则增加其耐受性[14]。辅助激活蛋白Fis参与到重组和DNA修复过程,稳定某些启动子的局部DNA结构,对应不同的生长条件而改变其转录活性,它也可以促进AcrAB转录。

3 大肠埃希菌外排泵抑制剂的探索

随着抗菌药物的大量使用,大肠埃希菌在选择性压力下不断发展其耐药机制,造成日益严重的耐药问题。探索解决其耐药方法已经刻不容缓,根椐对大肠埃希菌外排系统的了解和研究,可以从以下2个方面着手。

3.1 干扰外排泵组装的抑制剂 Globomycin是一种链霉菌来源的环肽结构的抗菌药物,它是脂蛋白信号肽酶LspA的抑制剂,通过抑制LspA从而抑制含有L spA剪接位点的膜融合脂蛋白前体的加工。大肠埃希菌和产气肠杆菌组成表达RND型外排泵AcrAB-TolC的组件AcrA前体且含有L spA的剪接位点,在Globomycin的作用下不能形成成熟的AcrA,也不能和外排泵的其他组分结合形成外排泵,抑制了外排泵的作用。文献报道75μmol/L Globom ycin能够使表达AcrAB-TolC的产气肠杆菌的氯霉素最低抑菌浓度(M IC)降低至原值的1/4,其外排泵抑制能力与羰酰氰间氯苯腙(carbonyl cyanidemchlorophenylhydrazone,CCCP)(100μmol/L)相同,低于PAβN (100μmol/L,M IC降低至原值的1/8)。

3.2 阻断外排泵能量来源的抑制剂 大肠埃希菌的外排泵主要由质子动力势驱动。对细菌多重耐药外排泵抑制剂的研究发现,以阻断外排泵能量来源为机制的外排泵抑制剂主要针对质子动力势[15]。例如CCCP其分子在解离状态下,导致转运蛋白失去能量供应,破坏外排系统的主动外排作用,使药物在细菌体内的累积量增加,恢复细菌对药物的敏感性,因此,它是很强的解耦联剂。CCCP作为外排泵抑制剂对大肠埃希菌AcrAB和AcrEF、产气肠杆菌AcrAB-TolC、空肠弯曲杆菌CmeABC等均有抑制作用。例如,100μmol/L的CCCP可以使表达AcrAB-TolC的产气肠杆菌的氯霉素M IC降低至原值的1/4[16]。

4 展 望

目前,对大肠埃希菌的外排泵的结构、调控方式及如何抑制它的外排泵有了一定的认识和了解,但是研究仅限于体外实验,并且这些抑制剂大多对人体有不良反应。许多在体外活性良好的外排泵抑制剂由于安全性、特异性、机制明确性等诸多问题未能用于临床治疗。外排泵抑制剂不仅可以提高具有外排泵介导耐药性的病原细菌的药物敏感性,恢复抗菌药物的抗菌活性,还有利于减少由外排作用促进的耐药突变株的产生。除了对外排泵抑制剂的研究还需要临床工作者注意合理使用抗菌药物。(1)根据体外检测药敏结果使用抗菌药物,对患者实行个体化用药;(2)抗菌药物的剂量要适当,注意由于剂量不足而造成耐药性的产生,疗程应尽量短;(3)根据细菌耐药和发展趋势,有计划地将抗菌药物分批分期交替使用可能是一项重要措施;(4)在医院内严格执行消毒隔离制度,以防耐药菌的交叉感染[17]。因此,寻找有应用前景的外排泵抑制剂并合理使用抗菌药物对于细菌性感染的治疗有着深远的意义。

[1]Poole K.Efflux-mediated antimierobial resistance[J].J Antimicrob Chemother,2005,56(1):20.

[2]Touze T,Eswaran J,Bokma E,et al.Interactions underlying assembly of the escherichia coli AcrAB-TolC multidrug efflux system[J].JMol M icrobiol,2004,53(2):697.

[3]M ikolosko J,Bobyk K,Zgurskaya H I,et a1.Confo rmational flexibility in the multidrug efflux system p ro tein AcrA[J].Structure,2006,14(3):577.

[4]Lobedanz S,Bokma E,Symmons M F,et al.A perip lasmic coiled-coil interface underlying TolC recruitment and the assembly of bacterial drug efflux pumps[J].Proc Natl Acad Sci USA,2007,104:4612.

[5]Deniaud A,Goulielmakis A,Covès J,et al.Differences between CusA and AcrB crystallisation highlighted by p rotein flexibility[J].PLoSOne,2009,4(7):e6214.

[6]Seeger MA,Schiefner A,Eicher T,et a1.Structural asymmetry of AcrB tfimer suggests a peristaltic pump mechanism[J].Science,2006,313:1295.

[7]Higgins CF.Multip le molecular mechanism s fo r multidrug resistance transporters[J].Nature,2007,446:749.

[8]Ramos JL,Martlnez,Bueno M,Molina-Herares AJ,et al. The TetR family of transcrip tional rep resso rs[J].M icrobiol Mol Biol Rev,2005,69(2):326.

[9]Li M,Gu R,Su CC,et a1.Crystal structure of the transcriptional regulato r AcrR from Escherichia coli[J].JMol Biol,2007,373:591.

[10]Webber MA,Talukder A,Piddock LJV.Contribution of mutation at amino acid 45 of AcrR to AcrB exp ression and cipmfloxacin resistance in clinical and veterinary Escherichia coli isolates[J].Antimicrob Agents Che, 2005,49(10):4390.

[11]Herve N,Vincent P,Stuart B.Levy,increased genome instability in escherichia coli ion mutants:relation to emergence of multip le-antibio tic-resistant(Mar)mutants caused by insertion sequence elements and large tandem [J].Antimic Agents Chem,2007,51(4):1293.

[12]Eiji Nikaido,Akihito Y,Kunihiko N.AcrAB m ultidrug efflux pump regulation in salmonella enterica serovar ty-phimurium by RamA in response to environmental sig-Snals[J].JBio Chem,2008,283(35):24245.

[13]David K,A lexey R.MarA-mediated overexp ression of the AcrAB efflux pump results in decreased suscep tibility to tigecycline in Escherichia coli[J].J Antimicrobial Chemotherapy,2008,61:46.

[14]Taketo K,Kameino L,Fujisawa I.High hydrostatic p ressure treatment impairs AcrAB-TolC pump resulting in differential loss of deoxycholate Tolerance in Escherichia coli[J].J Bio Bioeng,2005,100:6.

[15]Paixão L,Rodrigues L,Couto I,et al.Fluorometric determination of ethidium bromide efflux kinetics in Escherichia coli[J].J Biol Eng,2009,3:18.

[16]Mallea M,Chevalier J,Eyraud A,et a1.Inhibito rsof antibiotic efflux pump in resistant Enterobacter aerogenesstrains[J].Biochem Biophys Res Commun,2002,293 (5):1370.

[17]周安宇.746例痰标本中的病原菌分布及耐药性分析[J].重庆医学,2008,37(11):1327.

book=6,ebook=307

10.3969/j.issn.1671-8348.2010.19.057

R378.21;R969.3

A 文献标识码:1671-8348(2010)19-2670-04

2010-04-10

2010-05-28)