苹果酸舒尼替尼对人结肠癌细胞株LoVo的增殖抑制作用

卢康荣，周 娅，杜 玮，王万山

(1.南方医科大学教育部/广东省共建“重大疾病的转录组与蛋白质组学重点实验室”，广州 510515;2.广州军区联勤部卫生部 510063;3.广州军区广州总医院 510010;4.南方医科大学比较医学研究所，广州 510515)

苹果酸舒尼替尼(sunitinib malate，S U11248)是一种高选择性多靶点小分子蛋白激酶抑制剂，2006年获得美国食品与药品监督管理局(FDA)批准上市，主要用于治疗转移性肾细胞癌(RCC)和不能耐受或伊马替尼治疗失败的转移性胃肠道间质瘤(GIST)。Sunitinib能抑制多种信号通路，同时具有抗血管生成和抗肿瘤增殖的活性。对血小板衍生生长因子受体(PDGFR)α、β，血管内皮生长因子受体(VEGFR)1、2、3，干细胞生长因子受体(c-kitR)，FMS酪氨酸激酶-3(Flt-3)，集落刺激因子受体1(CSF-1R)和胶质细胞源性神经营养因子受体(RET)等多种受体酪氨酸激酶均有抑制作用。

以往研究显示，Sunitinib具有广谱的抗肿瘤活性，在非小细胞肺癌、乳腺癌、肾癌、黑色素瘤、神经胶质瘤、鳞状上皮细胞癌模型中，Sunitinib有抑制肿瘤细胞生长和转移的作用[1-3]。本实验将Sunitinib作用于人结肠癌细胞株LoVo，利用四亚基噻唑蓝(M TT)法和台盼蓝拒染法检测其生长抑制作用，并用流式细胞仪检测细胞周期，电镜观察细胞凋亡情况，以此探讨Sunitinib对结肠癌细胞的杀伤作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人结肠癌Lo Vo细胞由南方医科大学珠江医院肿瘤科提供，常规培养于 RPMI-1640完全培养基内，置于37℃、50 m L/L CO2的湿化环境中培养。Sunitinib购自辉瑞公司。MT T、碘化丙啶(PI)和二甲基亚砜(DMSO)均购自美国Sigma公司。胰蛋白酶购自美国Amresco公司，胎牛血清购自GIBCO公司。顺铂(C-DDP，20 mg/支)购自锦州九泰药业有限责任公司，其他常用化学试剂购自广州化学试剂厂。酶标仪(STA T FAX-2100)购自广州倍威仪器有限公司，另外还有透射电子显微镜HITACHI H-7500、流式细胞仪BD FACSAria等。

1.2 M TT法测定细胞抑制率 取对数生长期的细胞，用25 g/L的胰酶消化后，离心后计数，用含100 m L/L胎牛血清的RPMI-1640培养基配成5×104个/m L的细胞悬液，接种在 96孔板中，每孔接种 200μL，每组设 6个复孔，置于37℃、50 m L/L CO2的细胞培养箱中培养24 h。待细胞贴壁，再按要求加入不同浓度的药物，培养48 h后，每孔加入20μL含 20 mmol M TT，继续培养4 h后，吸去培养孔中的液体，每孔加入150μL DMSO，在微量振荡器上振荡10 min。然后在酶标仪上以570 nm的波长测定光密度值A值。结果判定:细胞生长抑制率=[(空白对照组孔平均A值-实验组孔平均A值)/空白对照组孔平均A值]×100%。将Sunitinib的浓度分别设为1.25、2.5、5、10、20 μM ，实验设立阳性和阴性对照组。

1.3 台盼蓝拒染法测定生长曲线 将细胞用100 m L/L胎牛血清、RPMI-1640培养基配成100×104个/m L的细胞悬液，然后接种在96孔培养板上，每孔200μL，实验组加入不同浓度的受试药物，空白对照组加入等体积的溶剂，每个浓度设置6个复孔，置于37℃、50 m L/L的CO2的细胞培养箱中培养24 h后，按照空白对照组和实验组给予处理。然后予 0、1、2、3、4、5、6 d各取样40μL，加入 4 m L/L 台盼蓝液 10 μL，计数细胞数。每孔计数3次，取均值，再累计5孔均值，根据细胞浓度值的对数值与时间作用绘图，即为细胞生长曲线，实验重复3次。阳性对照组设为顺铂 10μg/m L。

1.4 流式细胞仪测细胞周期 实验分为实验组(2.5、5、10、20 μM)和阴性对照组(加入等量的生理盐水)。以5×104个/mL的细胞密度接种于6孔板上，待细胞增殖至80%融合时给予药物刺激。作用24 h后用胰酶消化细胞，2000 r/min离心5 min，弃上清液，收集细胞，用 D-Hanks′液清洗2次，离心，70%乙醇4℃固定。将固定的细胞以4000 r/min离心5 min，用D-Hanks′液清洗 1～2次，沉淀物悬浮于 0.5 m L的PI和5μL的RNase酶中，避光放置染色30 min，200目筛网过滤。用流式细胞仪作DNA周期分析。

1.5 透射电镜观察凋亡细胞形态 以5×104个/mL的细胞密度接种于10 cm的培养皿中，待细胞增殖至80%融合时，加入实验药物，使其终浓度为10μM ，作用24 h后，消化，收集细胞，用D-Hanks′液漂洗，1200 r/min离心 10 min，细胞团块用2.5%戊二醛固定2 h，再用1%锇酸固定 1 h，常规梯度脱水，醋酸铀染色，EPON 812包埋，超薄切片，经柠檬酸铅染色后封片，透射电镜下观察、照相。

2 结 果

2.1 Sunitinib对Lo Vo细胞抑制作用的观察 浓度为1.25、2.5、5、10、20μM 的Sunitinib作用于肿瘤细胞后的M TT结果显示:该药对Lo Vo细胞有明显的生长抑制作用，在10μM 浓度处细胞抑制率已经达到65.81%，且有明显的剂量效应关系，相关系数为 r=0.694(P＜0.004)。20μM 的抑制率反而不高，可能与药物浓度过大有关(表1)。

2.2 Sunitinib对LoVo细胞抑制作用的时间效应关系观察生长曲线显示，Sunitinib的各个浓度对肿瘤细胞生长均有抑制作用，其中以24 h的抑制作用最为明显。尤其在10～20μM浓度范围内抑制作用较为明显(图1)。

2.3 流式细胞仪观察 用不同浓度的Sunitinib处理24 h后，Lo Vo细胞周期各个时相分布也相应发生改变，处于G0/G1期的细胞比例随着 Sunitinib作用浓度的升高而增加，当Sunitinib的浓度为10μM时，G0/G1期细胞达63.6%，而阴性对照组(未加 Sunitinib处理组)24 h后G0/G1期细胞仅为46.8%，与用药组比较，差异有统计学意义(P＜0.01);S期细胞的比例则随Sunitinib作用浓度的增加呈现递减趋势。表明Sunitinib使LoVo细胞阻滞在G0/G1期(表2)。

表1 Sunitinib对结肠癌LoVo细胞生长的抑制作用(，%)

表1 Sunitinib对结肠癌LoVo细胞生长的抑制作用(，%)

Sunitinib浓度(μg/m L)IR C-DDP Sunitinib 1.25 0 16.19±0.1242.5 20.34±0.027 23.81±0.219558.65±0.014 41.06±0.14910 67.04±0.048 65.81±0.24620 53.13±0.034 58.68±0.028

图1 Sunitinib对结肠癌LoVo细胞作用的生长曲线

表2 不同浓度的Sunitinib对LoVo细胞周期的影响(，%，n=6)

表2 不同浓度的Sunitinib对LoVo细胞周期的影响(，%，n=6)

与空白对照组比较，*:P＜0.01。

组别 细胞凋亡率细胞周期G0/G1 S G2/M空白对照组 0 46.8±1.32 49.7±0.21 2.41±0.28 Sunitinib浓度(μg/mL)1.25 14.3±0.58*62.7±5.54* 9.1±4.34* 8.4±5.12*2.5 16.7±0.69*61.5±5.56* 8.4±3.67* 8.2±7.981*519.0±0.73*63.2±5.42* 7.5±5.12* 8.1±6.98*10 21.3±0.83* 63.6±6.21* 7.4±4.67* 5.7±6.54*20 25.6±0.74* 65.5±6.28* 7.9±4.32* 8.1±5.21*

图2 10μM Sunitinib作用于 Lo Vo细胞24 h后的电镜图像

2.4 透射电子显微镜观察 10μM Sunitinib作用于LoVo细胞24 h后，细胞发生凋亡，体积缩小，胞膜完整但发生皱缩，细胞核固缩，核内染色质向核膜边缘凝聚、固缩、边聚(图2)。

3 讨 论

受体酪氨酸激酶(RTK)属于Ⅲ和Ⅴ类裂解激酶域家族成员，它们的功能异常与多种实体瘤和造血系统恶性肿瘤的发生和发展相关。RTKs由细胞外的配体结合域和细胞内的催化结构域构成。RTK受体与配体结合后，受体寡聚化，并且自磷酸化而激活下游信号通路。该信号传导的级联反应最终促使细胞存活和增殖，如肿瘤细胞通过分泌VEGF和PDGF直接作用于内皮细胞促进血管新生，使肿瘤生长、增殖和转移。Sunitinib能抑制体内多种受体RTK的磷酸化作用，特别是对与肿 瘤相关 的受 体 RTK、PDGFR、RET、KIT 等，以 及PDGFRβ-和 VEGFR2-依赖的肿瘤血管生长因子显示很强的抑制作用，对肿瘤生长和转移显示抑制作用[3-4]。2006年1月FDA批准舒尼替尼用于治疗转移性肾细胞癌和不能耐受或伊马替尼(甲磺酸伊马替尼、imatinib mesylateG、Gleevec)治疗失败的胃肠道间质瘤(GIST)患者。实验显示，在放、化疗同时加用舒尼替尼有助于增强放、化疗的抗肿瘤效应[5]。

本实验应用Sunitinib作用于人结肠癌细胞，观察其对Lo-Vo细胞的生长抑制作用。实验结果显示在1.25～20μM的浓度范围内对LoVo细胞有不同程度的抑制作用，体外实验药物作用浓度范围对临床用药选择最佳给药浓度具有借鉴意义。细胞生长曲线除了显示Sunitinib有较明显的生长抑制作用外，还较直接地反映了其对肿瘤细胞生长抑制的动态变化情况。细胞凋亡是一个细胞主动参与的复杂的病理生理过程，近年来的研究表明，许多抗肿瘤药物可以诱导肿瘤细胞凋亡，可能是抗肿瘤药物抑制肿瘤细胞生长的机制之一。化疗药物主要是通过诱导肿瘤细胞凋亡来达到治疗目的，肿瘤细胞对化疗药物的敏感性决定了化疗的效果。本研究中Sunitinib作用于Lo Vo细胞后，电镜观察结果显示细胞体积缩小，胞膜完整但发生皱缩，细胞核固缩，核内染色质向核膜边缘凝聚、固缩、边聚等凋亡的特异性变化。流式细胞仪还观察到Sunitinib对肿瘤细胞DNA合成期及G2/M期的阻滞。

细胞凋亡是基因导向的细胞自我消灭的过程，通过细胞内的核酸内切酶，使核小体间的DNA裂解成碎片，继而核裂解，导致细胞死亡。它是通过外源性或内源性的凋亡信号，激活细胞内编码的自杀程序而促发的[6-7]。本实验观察到Sunitinib对结肠癌细胞的抑制作用可能是通过诱导细胞凋亡实现的。

[1]Mendell BD，Laird AD ，Xin XH，et al.In vivo antitu-mor activity of S U11248，a novel tyrosine kinase in-hibitor targeting vascular endothelial grow th factor andplatelet-derived grow th factor receptors[J].Clin Cancer Res，2003 ，9(1):327.

[2]Abram s TJ，Lee LB，Murray LJ，et al.SU 11248 inhibits KIT and platelet-derived grow th factor receptorβin preclinicalmodels of human smallcelllungcancer[J].Molecular Cancer Therapeutics，2003，2(2):471.

[3]Chow LQ，Eckhardt SG.Sunitinib:from rational design to clinicalefficacy[J].J Clin Oncol，2007 ，25(7):884.

[4]Le Tourneau C ，Faivre S ，Raymond E.New developments inmultitargeted therapy forpatientswith solid tumours[J].Cancer Treat Rev，2008，34(1):37.

[5]董肖椿，周福生，闻韧.抗肿瘤药物苹果酸舒尼替尼的合成[J].中国药物化学杂志，2008，18(1):28.

[6]周桔，罗荣保，汤长发，等.bcl-2蛋白家族和p53基因在细胞凋亡中的调控效应[J].中国组织工程研究与临床康复，2007，11(10):1950.

[7]耿礼文，赵韶春，梁桃.舒林酸抑制结肠癌细胞株增殖诱导凋亡[J].重庆医学，2008，37(15):1704.