小鼠白细胞介素23基因在毕赤酵母中的诱导表达及初步活性研究

杨建岭 姚智燕 杨艺红魏 林 (河北医科大学免疫学教研室,石家庄050017)

小鼠白细胞介素23基因在毕赤酵母中的诱导表达及初步活性研究

杨建岭 姚智燕 杨艺红①魏 林 (河北医科大学免疫学教研室,石家庄050017)

目的:克隆小鼠白细胞介素23(mice interlecukin-23,mIL-23)基因,构建高效稳定的毕赤酵母表达菌株,并对得到的蛋白进行生物活性的初步测定。方法:采用聚合酶链式反应(PCR)技术从pcDNA3-mIL-23上分别扩增获得IL-23的两亚基p19和p40,并通过重叠PCR(over-lap PCR)技术获得含有连接子的p1940,构建pPICZαA-IL-23重组质粒;采用甲醇诱导毕赤酵母表达重组蛋白,MTT方法检测诱导表达蛋白的促淋巴细胞增殖情况。结果:SDS-PAGE分析显示在诱导24小时和36小时后的上清及24～96小时的沉淀中均可以检测到约70 kD的诱导条带。Western blot印迹法证实了重组蛋白为特异性蛋白。上清和沉淀中表达的重组蛋白IL-23能促进外周血单个核细胞的增殖,OD570 nm分别达到(0.235±0.029)和(0.216±0.035),而未刺激的对照组只有(0.135±0.008)和(0.164±0.017)。结论:成功构建出mIL-23的酵母表达载体,诱导产生的蛋白可以明显地促进外周血单个核细胞的增殖。

白细胞介素23;克隆表达;毕赤酵母;生物活性

白细胞介素23(IL-23)是近期发现的具有多种效应的促炎症细胞因子之一,属于 IL-12家族,由p19和p40两个亚基组成[1]。IL-23是类似于 IL-6、IL-12的促炎因子,在Th0向Th17细胞的分化起始及维持Th17分化、发育中起关键性作用[2,3]。IL-23是由活化的Ⅰ型巨噬细胞和树突状细胞分泌,可以刺激记忆性T淋巴细胞的分化和增殖,也可以促进IL-17的释放[1],还是连接固有免疫应答和适应性免疫应答的桥梁[4]。已有研究证实IL-23与类风湿性关节炎、肠炎、幽门杆菌引起的胃炎、牛皮癣等炎症性疾病密切相关[5,6]。IL-23和IL-12部分地决定了免疫应答的走向是Th17还是Th1类型,越来越多的研究表明了IL-23在免疫系统中的重要作用[2,4,7]。

而目前尚无IL-23在酵母系统中的大量表达的报道。为了进一步研究IL-23的免疫学活性及其在Th17发育过程中的确切作用机制,本文通过基因工程的方法在毕赤酵母中表达出IL-23蛋白,并对其生物学活性进行了初步的研究,为深入研究IL-23在免疫应答网络中扮演的角色和寻找治疗慢性炎症疾病靶位点奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 菌株与质粒 大肠杆菌 E.coliDH5α、毕赤酵母X-33、质粒pcDNA3-mIL-23、pPICZαA由本室保存。1.2 酶及主要试剂 限制性内切酶、T4 DNA连接酶、小提质粒试剂盒、Taq DNA聚合酶及dNTP均购自TaKaRa公司,抗生素Zeocin购自Invitrogen公司;兔抗His的一抗和山羊抗兔IgG的荧光二抗为R&D产品,其它试剂皆为分析纯。

1.7 mIL-23在毕赤酵母中的诱导表达 将阳性单克隆于25 ml BMGY中,28℃摇培16～18小时,至OD600 nm>2;4 000～5 600 r/min离心5分钟,收集菌体弃上清,加100～150 ml BMMY稀释至OD600 nm=1.0,于1 L培养瓶中继续28℃摇培。分别在0、6、12、24、36、48小时时收集1 ml菌液,离心后上清与沉淀分别冻存。每隔24小时,补加100%甲醇至终浓度为5%,补加氨水至终浓度0.25%。

1.8 表达产物的SDS-PAGE和Western印迹分析上述上清30μl,加入2×SDS-PAGE上样buffer(50 mmol/L Tris HCl,100 mmol/L DTT,2%SDS,10%甘油)煮沸10分钟,8 000 r/min离心5分钟后,上清在10%的聚丙烯酰胺凝胶中电泳。而上述沉淀则需经过裂解制备样品,首先在菌体中加100μl的Breaking Buffer悬起,加等量的 acid-washed glass beads(0.5 mm),30秒涡旋,冰上30秒,重复8次;4℃最大转速离心10分钟,上清同前述进行SDS-PAGE。考马斯亮兰染色后,扫描电泳结果。此外,表达产物SDSPAGE后采用电转印方法将凝胶上的蛋白转移至硝酸纤维素膜(NC膜)上,NC膜置于含5%脱脂奶粉的PBST(封闭液,blocking buffer)中室温封闭过夜;一抗为兔抗His的单克隆抗体(1∶1 000稀释),室温孵育1小时,PBST洗涤3～4次,10 min/次;二抗为荧光标记的山羊抗兔IgG,室温孵育1小时,洗膜后在ODESSY上扫膜。

1.4 克隆构建 分别以P19F/P19R、P40F/P40R为引物,质粒pcDNA3-mIL-23为模板PCR扩增p19和p40。然后分别以p19和p40两者的扩增产物为模板,以p19F/p40R为引物,over-lap PCR扩增p1940。p1940与载体pPICZαA同时经XhoⅠ、NotⅠ酶切后,分别回收目的基因和载体片段并连接,T4 DNA连接酶4℃连接过夜,转化DH5α,于含有25μg/ml Zeocin的LLB上涂板。挑取克隆,进行菌体PCR后挑取阳性克隆抽提质粒,应用XhoⅠ、NotⅠ双酶切鉴定后测序。

1.5 电击转化酵母 使用 SacⅠ内切酶线性化pPICZαA-mIL23,酶切产物电泳并胶回收纯化,定量1 μg线性化的pPICZαA-mIL23加至含有100μl酵母感受态X-33的2 mm电转杯中,电击参数:1.5 K V,25 μF,200欧姆,电击后立即加入1 ml Sorbitol,转入10 ml离心管,30℃静置1小时后加入1 ml YPD,30℃, 200 r/min摇1小时,取50～200μl菌液涂于含有100 μg/ml Zeocin的YPDS平板。

1.6 酵母克隆的筛选鉴定 为筛选在AOX1位点同酵母菌发生重组的Mut+表型克隆。随机挑取Zeocin+抗性克隆先后点在MM(1.34%Y NB 4×10-5%biotin 0.5%methanol)、MD(1.34%Y NB 4×10-5%biotin 2%dextrose)上,30℃培养2天。选择在两

2 结果

2.1 pPICZαA-mIL23表达载体的构建筛选鉴定PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析,在分子量约为1 007 bp和591 bp位置可见清晰特异的条带,分别与预期的p40和p19大小一致。将两者混合后进行重叠PCR,产物进行电泳分析后,在分子量为约

1.6 kb的位置可见清晰条带,与预期p1940大小一致。用XhoⅠ/NotⅠ分别将p1940和pPICZαA进行双酶切消化,产物胶回收连接、转化、抽提质粒。构建成的pPICZαA/mIL-23酵母表达载体,进行菌体PCR扩增和XhoⅠ/NotⅠ双酶切电泳分析,均可见大小约为1.6 kb的片段,进行SacⅠ单酶切后电泳分析可见大小为5.5 kb的片段,而SacⅠ单酶切消化pPICZαA后的电泳分析仅可见3.9 kb的片段。以上鉴定均表明成功构建了重组载体pPICZαA/mIL-23,见图1。

2.2 表达载体电转化酵母后的克隆筛选与鉴定线性化的pPICZαA/mIL-23电击转化酵母菌X-33后,挑取Zeocin+抗性的克隆,进行Mut的表型筛选。表型为Mut+的克隆在两块板上都会有良好的生长,而表型为Muts的克隆仅能在MD板上正常生长,而在MM板上则生长很慢甚至或者就停止生长。以此判断的克隆的Mut+克隆以P19F/P40R为引物进行菌体PCR。正确重组了mIL-23基因的酵母克隆能够扩增获得1.6 kb的片段,见图2。

图1 pPICZαA-mIL23表达载体的构建与鉴定Fig.1 Construction and identification of pPICZαA-mIL23

图2 Mut的表型筛选及Mut+克隆的PCR鉴定Fig.2 Determining the Mut Phenotype and PCR identification of Mut+clones

图3 重组质粒工程菌表达 IL-23产物的 SDS-PAGE及Western blotFig.3 Analysis of IL-23 expression in engineered yeast by SDS-PAGEand Western blot

2.3 表达产物的SDS-PAGE及Western blot 表达载体在BMMY和BMGY中通过甲醇和氨水诱导后,对各组样品进行SDS-PAGE电泳:发现在24、36小时的上清中可以检测到大小为70 kD左右的蛋白。同时,诱导了24、36小时的沉淀也可以检测到诱导条带,而空载体诱导后的上清及沉淀均未检测到相同的诱导条带。由于在表达载体pPICZαA上带有his标签,而Western免疫印迹表明表达产物与兔抗His的单克隆抗体有特异性结合,且对应了mIL-23加上α-factor及his的蛋白分子量大小,证实诱导表达获得了预期的蛋白,见图3。

图4 诱导表达产物对外周血单个核细胞增殖的促进作用Fig.4 The promotion effect of induced products on the proliferation of PBMC

2.4 表达产物的生物活性测定 为了检测诱导表达产物的生物学活性,我们应用MTT实验检测了其对PBMC的增殖影响。获得的表达产物较明显的刺激了PBMC的增殖,24、36小时的诱导上清及沉淀均使OD570 nm值达到0.216以上,而未诱导的对照组及空白组只有0.134,提示获得的诱导产物mL-23具有其生物学活性,见图4。

3 讨论

作为一个在结构和功能上同IL-12类似的免疫分子——IL-23,近期已经成为细胞因子研究中的热点。IL-23是一类异二聚体,由一个19 kD的α亚基和一个40 kD的β亚基共同折叠而成[1,2]。小鼠和人类IL-23p19亚基具有70%的同源性,并且与IL-12p35也具有很高的同源性。此外,IL-23和IL-12含有共同的p40亚基和受体 IL-12 Rβ1[2]。这说明 IL-23与IL-12在功能上有一定的相似性,但又不完全相同。在动物模型和人体上的实验都表明了IL-23在起始和产生免疫应答方面起着重要作用。相反, IL-23的表达失控,会加剧炎性疾病的发生[8]。

具有生物活性的IL-23的合成,要求p40和p19是在同一细胞内表达的[2,4]。再加上 IL-23的分子量(60 kD左右)较大,使得在真核系统内表达IL-23变得较为困难。为了mIL-23在翻译后较易折叠修饰成有活性的蛋白,本研究在p19和p40两亚基间添加了5个中性氨基酸的连接子将其克隆至毕赤酵母表达载体pPICZα-A。此载体为高效的酵母融合表达载体,其N-端具有α-factor信号肽同时 C端有6×His标签,使得所表达的蛋白可以分泌到胞外而且便于鉴定。因此我们获得的mIL-23酵母表达菌株诱导后,在上清和沉淀中均有表达。我们的研究与文献报道相一致,与对照组的空载体相比,克隆了mIL-23的实验组明显促进了PBMC的增殖,并证实了诱导后的产物具有生物学活性。而已有研究表明,IL-23是一类重要的炎性细胞因子,不仅参与Th1型免疫应答而且与Th0向Th17的分化及IL-17的分泌相关[3]。IL-23/IL-17轴线的免疫调节和IL-23在慢性炎症疾病中的发生发展上都与IL-23密切相关[5,9]。因此,我们成功获得的mIL-23表达菌株不仅为进一步研究其生物学活性及分子机制奠定基础,而且为慢性炎症疾病的治疗提供了新的方法和途径。

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[收稿2009-08-23 修回2009-11-04]

(编辑 倪 鹏)

Expression of mice interlecukin-23 in pichia and preliminary studies on its biology function

YANG Jian-Ling,YAO Zhi-Yan,YANG Yi-Hong,WEI Lin.Department of Immunology,Hebei Medical University,Shijia zhuang050017,China

Objective:T o clone the mice interleukin-23(mIL-23)and express it in Pichia efficiently.Methods:Two subunits of IL-23 were amplified by PCR from pcDNA3/mIL-23,and ligated together with adaptor by over-PCR.The IL-23 cDNA confirmed by sequencing was inserted into expressing vector pPICZαA and expressed inPichiaX-33 strain.IL-23 protein expression was induced by methanol and ammonia. The recombinant IL-23 was identified by immunoblot and its biological activity was analyzed.Results:DNA sequencing confirmed that cloned cDNA was identical to the published sequence of mIL-23.The recombinant plasmid pPICZαA/mIL-23 was electroprated into X-33.An expected 72 kD protein of mIL-23 wasfounded both in the induced pellets and supermatants by SDS-PAGE and coomassie blue staining.The 72 kD protein could be recognized in Western blot.While we could detect bands at 72 kD in cell pellets induced more than 24 h by Western blot.Detected by Western blot using anti-His antibody,we could see positive band at 72 kDfrom supernatants induced 24 and 36 h.While we could detect band at 72 kD in cell pellets induced between 24 h and 96 h.Meanwhile,we could see obviously proliferation of mice peripheral blood mononuclear cells(PBMC)treated with the induced pellets and supermanants.Conclusion:We have successfully expressed mIL-23 protein inPichia and the expressed product has its bioactivity in promoting the proliferation on PBMC.

IL-23;Gene clone and exprssion;Pichia;Bioactivity

R392.11 文献标识码 A 文章编号 1000-484X(2010)02-0120-04

①河北师范大学生命科学学院分子细胞研究室,石家庄050016

杨建岭(1981年-),男,硕士,助教,主要从事感染免疫的研究,E-mail:yjianling@126.com;

及指导教师:魏 林(1961年-),女,教授,博士生导师,主要从事感染免疫学研究,E-mail:weilin21@ sina.com。