六味地黄生物制剂对雄性残疾果蝇衰老的影响*

夏少秋 朱 颖 赵 越 广东药学院中药学院(广州 510006)

果蝇衰老的进程中会出现触角,腿以及部分翅膀的损伤,而这些损伤会造成血淋巴的丢失,血淋巴含有水和营养物质,这些物质可能是果蝇生存的必要物质[1]。本实验人为造成果蝇腿损伤,可能提前使果蝇进入衰老状态。再用六味地黄生物制剂喂饲这些损伤的果蝇,考察其能否延缓衰老。

六味地黄丸能滋阴补肾,用于肾阴亏损,头晕耳鸣,腰膝酸软,骨蒸潮热,盗汗遗精,消渴[2]。研究表明 ,六味地黄方能改善机体自由基代谢,增强机体免疫机能,补充机体必需物质,抗DN A损伤作用,改善学习记忆能力,从而起到延缓衰老的作用[3]。六味地黄生物制剂 (LiuweidihuangDecoction Metabolized by Photosynthetic bacteria,简称 LW-PSB)是通过光合细菌代谢传统的六味地黄汤,既能增强其抗衰老的作用,又因添加了光合细菌使得该生物制剂营养更丰富。本实验是前期研究表明六味地黄生物制剂的抗衰老作用明显优于传统的六味地黄汤。本实验研究其对残疾的雄性果蝇衰老的影响[4]。

1 方法和材料 1.1 器材与试剂白砂糖、琼脂、玉米粉、酵母粉(均为食品级 );丙酸 (均为分析纯);恒温生化培养箱BOXUN SPX-250B-Z型(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)等。

1.2 六味地黄生物制剂的制备 熟地黄、山药、山茱萸、泽泻、牡丹皮、茯苓按处方的比例(8:4:4:3:3:3)配药。加 8倍量的水,文火煎煮 1.5h,滤过。药渣再加 6倍量的水煎煮 1.5h,滤过。合并滤液,浓缩至 0.5g/mL备用。按上述方法制备的六味地黄汤经自然发酵后,按一定比例加入光合细菌代谢 6个月即得。

1.3 培养基的制备 1.3.1 普通培养基制备:水 180 mL,白糖 13 g,琼脂 1.3 g,玉米粉 17 g,酵母粉 1.4 g,丙酸 1mL。

1.3.2 含药培养基制备:分别取 LW-PSB0.1g,0.2g加入到 100 g普通培养基中,得到浓度为 0.1%,0.2%的含药培养基。

1.4 动物 美国野生型黑腹果蝇(Drosophila melanogaster),温度为 (25± 1)℃ ,相对湿度为 (60± 5)% 环境,12 h光照,12 h黑暗交替培养。

1.5 实验方法 1.5.1 交配实验:收集 8 h内新羽化黑腹雄雄性果蝇成虫,低温麻醉 ,做如下处理:组Ⅰ剪去果蝇一侧中足全腿;组Ⅱ剪去果蝇两侧中足腿尖;组Ⅲ果蝇不做任何处理。每组 10只果蝇,普通培养基饲养 20d。于第 21天将雌雄合并,合并方法:Ⅰ雄性果蝇和正常雌性果蝇;Ⅱ雄性果蝇和正常雌性果蝇;Ⅲ雄性果蝇和正常雌性果蝇。从合并开始计时,记录 11 min内 ,22 min内,33 min内,44 min内交配的总数。每组重复实验 10次。

1.5.2 抗冻实验:收集 8h内新羽化黑腹雄性果蝇成虫,低温麻醉,果蝇处理方法同 1.5.1。每组 50只果蝇 ,普通培养基饲养 10d。于第 11天移入空的三角瓶中,置于-5℃环境中 4.5h,再与室温下 (14℃)复活 6h,观察果蝇存活只数。每组重复实验10次。

1.5.3 攀爬实验:收集 8h内新羽化黑腹雄性果蝇成虫,低温麻醉,果蝇处理方法同 1.5.1。每组 50只果蝇,普通培养基饲养 30d。于第 31天移入空的三角瓶中 ,再在其上覆盖一个空的三角瓶,观察 30min内攀爬上覆盖瓶中的果蝇只数。每组重复实验 10次。

1.5.4 寿命实验:收集 8 h内新羽化黑腹雄性果蝇成虫,低温麻醉,果蝇处理方法同 1.5.1。每组果蝇 100只。每 2天更换新鲜培养基。实验开始后,每天定点观察,记录果蝇死亡数,直到各组果蝇全部死亡为止。全部果蝇寿命的算术平均数为平均寿命,最后 10只果蝇寿命的算术平均数为最高寿命,前一半死亡的果蝇的寿命的算术平均数为半数死亡时间。平均延寿率(%)=(给药组平均寿命-空白对照组平均寿命)/空白对照组平均寿命×100%。统计各组果蝇平均寿命,最高寿命,半数死亡时间和平均延寿率。

1.6 统计学方法采用 SPSS16.0统计软件进行单因素方差分析,P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果 2.1 交配实验

表1 损伤对雄性果蝇交配行为的影响 (.D)

表1 损伤对雄性果蝇交配行为的影响 (.D)

与组Ⅲ比较:△P＜0.05;▲P＜0.01;◇P＜0.001。

组别 交配对数 /对11min 22min 33min 44minⅠ 0.67± 0.52▲ 1.00±0.89△ 1.50±0.84◇ 2.00±0.89◇Ⅱ 0.83± 0.75△ 1.50±0.55▲ 1.83±0.98▲ 2.50±1.05▲Ⅲ 2.00± 0.63 2.83± 0.75 4.00± 1.09 4.33± 0.82

从表 1可知,从 11 min到 44 min,组Ⅰ ,Ⅱ与组Ⅲ比较 ,组Ⅰ,Ⅱ的交配能力明显弱于组Ⅲ (P＜0.05,P＜0.01,P＜0.001)。这可能与果蝇腿损伤后,行动不便有关 ,还有与果蝇的交配方式有关。

2.2 耐寒实验

表2 损伤对雄性果蝇耐寒能力的影响 (.D)

表2 损伤对雄性果蝇耐寒能力的影响 (.D)

与组Ⅲ比较:△ P＜0.01。

组别 存活数 /只 平均存活率/%Ⅰ7.60± 6.99△ 15.2Ⅱ7.60± 6.55△ 14.6Ⅲ19.20±9.24 38.6

从表 2可知,组Ⅰ ,组Ⅱ与组Ⅲ比较均有显著性差异(P＜0.01),说明损伤的雄性果蝇抵御低温的能力比正常雄性果蝇低,可能是损伤引起内分泌失调有关。

2.3 攀爬实验

表3 损伤对雄性果蝇攀爬能力的影响 (.D)

表3 损伤对雄性果蝇攀爬能力的影响 (.D)

注:与组Ⅲ比较,△P＜0.001。组Ⅰ ,组Ⅱ与组Ⅲ比较均有显著性差异(P＜0.001)。

组别 攀爬数 /只 平均攀爬率/%Ⅰ13.83± 4.45△ 27.7Ⅱ13.00± 4.69△ 19.3Ⅲ29.33±7.58 58.7

2.4 寿命实验

表4 六味地黄生物制剂对雄性残疾果蝇寿命的影响(.D)

表4 六味地黄生物制剂对雄性残疾果蝇寿命的影响(.D)

与空白组比较:△P＜0.05;▲ P＜0.01;◇P＜0.001。

表 4可知,LW-PSB各浓度均能提高 2种损伤雄性果蝇半数死亡时间,并显示出及其显著的差异(P＜0.001)。另外,LW-PSB 0.2% 浓度组能显著延长 2种损伤雄性果蝇的平均寿命(P＜0.01,P＜0.001),并且延寿率达到 44.8%,24.2%。 LW-PSB各浓度组能显著提高模型一的最高寿命(P＜0.05,P＜0.001),但对模型二没有明显作用。另外,随着浓度的增加,抗衰老的效果也有增加的趋势。说明 LW-PSB不但能延缓衰老,而且能扭转果蝇衰老的状态,增强的生命活力。

3 讨 论 衰老是生物体在生命周期中随着年龄增长而发生的全身各组织器官功能衰退和稳态功能下降的过程,是机体各种生化反应的综合表现。人体衰老与机体细胞凋亡、免疫功能状态有着密切关系[5]。在衰老与抗衰老研究中,果蝇以其自身的诸多优势如高度纯种,培育简单,生存期短,繁殖能力强,观察指标明显,因而是研究抗衰老的好材料[6]。

本研究显示六味地黄生物制剂对残疾雄性果蝇的寿命、生殖能力、攀爬能力、耐寒能力均有明显的作用。从实验 1-3可以得出,残疾的雄性果蝇无论是交配能力,耐寒能力或者攀爬的能力都不及正常的雄性果蝇,而且都显示出显著性差异(P＜0.05)。这可能意味着人为造成果蝇残疾可以使果蝇提前进入衰老的过程。这些人为的伤害直接使果蝇行动不便,也可能直接或间接得使果蝇的代谢方面产生变化。所以,不管残疾果蝇是否真的提前进入衰老期,它们都要弱势于正常果蝇。

我们将质量浓度为 0.1%,0.2%的 LW-PSB喂饲这些残疾的果蝇,从实验 4可以看出,LW-PSB起到了很好的延缓衰老的作用。LW-PSB可以扭转残疾果蝇的弱势状态,提高生命活力,使得它们和正常的果蝇拥有一样的长的寿命,甚至活的更长。综上实验表明六味地黄生物制剂具有良好的延缓衰老的作用。鉴于生物衰老的原因和过程十分复杂,六味地黄生物制剂正丁醇提取物延缓衰老作用的其他机理,还需进行多方面的实验和临床研究。

[1]Sean Sepulveda,Parvin Shojaeian,Casandra L.Rauser,Mahtab Jafari,Laurence D.Mueller,Michael R.Rose. Interactions between injury, stress resistance,reproduction,and aging in Drosophila melanogaster[M].Experimental Gerontology,2008:43,136-145.

[2]中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国药典 [M].北京:化学工业出版社,2005:402.

[3]张大禄,范丙义,张 瑜,等.六味地黄方抗衰老作用研究 [J].中医药信息,2001,l8(6):19-21.

[4]王德秀,胡旭光,臧建伟,等.六味地黄汤生物制剂对肾阴虚小鼠 HPA轴的调节作用研究[J].陕西中医,2008,29(3):374-375.

[5]Hindra JS著,肖德桢.老年生物学与医学 [M].北京:科学出版社,1980:112.

[6]王厚德.老年学实验用果蝇饲养方法的研究 [J].老年学杂志,1987,7(2):44.