荧光法分析丙烯酰胺对人外周血淋巴细胞钙稳态的影响

王海雁，王晓丽，刘 宏，冯 峰

(山西大同大学化学与化工学院，山西大同 037009）

荧光法分析丙烯酰胺对人外周血淋巴细胞钙稳态的影响

王海雁，王晓丽，刘 宏，冯 峰

(山西大同大学化学与化工学院，山西大同 037009）

应用fura-2-AM荧光探针，研究不同剂量丙烯酰胺对淋巴细胞内钙离子稳定状态的影响，并探讨其作用机制.

丙烯酰胺 fura-2-AM 淋巴细胞 胞内钙离子浓度

丙烯酰胺(AA)可以引起人体神经，主要是周围神经的损害.国际癌症研究机构将丙烯酰胺列为2A组“可能人类致癌物”，欧盟认为其对人体存在潜在危险性[1]；但目前的人群流行病学调查资料尚未明确丙烯酰胺与癌症之间的相关性.Baum等认为420μg/mL的丙烯酰胺对V79细胞和人血淋巴细胞无明显的基因毒性，21～210μg/mL的环氧丙酰胺却能产生DNA损伤[2].Blasiak等证实0.035～3.5μg/mL丙烯酰胺对人外周血淋巴细胞产生潜在的基因毒性，3.5μg/mL丙烯酰胺诱导淋巴细胞DNA产生双链断裂，若细胞的自我修复过程中继续存在丙烯酰胺，则其导致的淋巴细胞DNA损伤无法完全修复[3].钙离子作为偶联胞外刺激和胞内反应的第二信使，参与淋巴细胞许多重要功能的调解[4].本研究应用fura-2-AM荧光探针，探讨究不同剂量丙烯酰胺对淋巴细胞内钙离子稳定状态的影响，并探讨其作用机制.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

Fura-2-AM(acetoxymethyl ester form of fura-2)、乌本苷(ouabain)、尼卡地平(nicardipine)和 N-2-羟乙基呱嗪-N-2-乙烷磺酸(HEPES，Sigma USA)；芋螺毒素 (ω-conotoxin，Alexis Biochemicals，Germany)；淋巴细胞分离液(上海试剂二厂)；细胞培养基RPMI 1640(Gibco BRL)；丙烯酰胺(AA)(＞99%) (Aldrich Milwaukee，WI，USA).VARIAN Cary-eclipse荧光磷光发光分光光度计(Varian USA)；BC-3000全细胞血液细胞分析仪 (深圳 Mindray Biomedical electronics CO.LTD)

1.2 实验过程

细胞生化应用软件 (Intracelluar Bio-chemistry Application)采集处理数据，双波长检测法(Ratio Data Collection)37℃条件下测试.激发波长分别为340 nm和380 nm，发射波长固定在510 nm，狭缝宽均为10 nm.仪器软件可根据公式 [Ca2+]i＝Kd×[(RRmin)/(Rmax-R)]×(Sf2/Sb2)直接得出胞浆内游离钙离子的浓度[5].其中Kd值在本实验条件下校正为187 nmol/L.文中数据为±s(n＝3～5)，统计学分析采用t-test，P＝0.05为检验水准.

2 结果与讨论

2.1 丙烯酰胺与Fura-2-Ca的作用

丙烯酰胺为小分子亲电子物质，能够穿透细胞膜，细胞膜上或胞内细胞器含有硫醇的蛋白质有可能成为其结合的靶位点[4].模拟细胞内生理液中丙烯酰胺和fura-2-Ca的作用见图1，可知模拟细胞内生理液中加入的丙烯酰胺对fura-2-Ca螯合物的荧光强度无影响.即在丙烯酰胺的作用下，若淋巴细胞内fura-2-Ca螯合物的荧光强度表达的胞内游离钙离子浓度 [Ca2+]i发生变化，是因为丙烯酰胺和淋巴细胞内某些蛋白相互结合作用的结果.

2.2 不同剂量丙烯酰胺对胞内钙离子稳定状态的影响

以淋巴细胞静息状态下的 [Ca]i100 nmol/L为对照，由图2a可见，终浓度低于70μg/mL剂量的丙烯酰胺使[Ca2+]i明显高于静息状态，△[Ca2+]i为正值；而高剂量的丙烯酰胺(＞70μg/mL)使[Ca2+]i呈剂量依赖性下降，△[Ca2+]i均为负值.150 s加入丙烯酰胺后(图2b)，低浓度(36μg/mL)的丙烯酰胺轻微刺激细胞，令胞内钙水平瞬间增加，100 s之内胞内游离钙离子达到一较高浓度平台，比作为对照的静息状态的细胞钙水平高出约25 nmol/L.低剂量丙烯酰胺明显升高胞内钙水平，是其激活外钙内流通道、抑制膜上钙泵、干扰细胞膜上能量调节机制，引起细胞钙调节机制变化的原因[5].浓度为70μg/mL时，测试时间之内胞内钙离子浓度会迅速降低10 nmol/L左右，并在之后400 s内缓慢恢复至原来钙水平；更高浓度的丙烯酰胺会刺激淋巴细胞内钙水平继续降低，在测试时间段胞内钙水平不会恢复，而且剂量越大，内钙流失越多，钙浓度均较对照显著降低(P＜0.01).高浓度丙烯酰胺作用下，丙烯酰胺小分子与胞内功能型蛋白结合，通过上调内质网和细胞膜上的钙泵表达，诱导胞内游离钙外流，从而降低淋巴细胞内的钙超载，说明高浓度的丙烯酰胺能够阻碍外钙信号逆浓度梯度的跨膜传达.揭示丙烯酰胺对人外周血淋巴细胞存在在低剂量的免疫兴奋效应和高剂量的免疫抑制效应.

图1 0～7 000μg/m L的丙烯酰胺对fura-2-Ca螯合物的荧光强度无影响

图2 丙烯酰胺对淋巴细胞胞内钙稳态的干扰

2.3 丙烯酰胺作用时间对胞内钙水平的影响

30 min之内随着孵育时间延长，丙烯酰胺浓度增大，其促进内钙外流的能力加强，存在明显的量效关系(图3).120 min后较低剂量丙烯酰胺(＜560μg/mL)作用下的淋巴细胞胞内游离钙离子浓度，接近静息状态钙水平，说明淋巴细胞有一定能力恢复较低剂量丙烯酰胺对胞内钙水平的扰动.

2.4 钙离子通道抑制剂对丙烯酰胺升钙作用的影响

钙通道非特异性抑制剂LaCl3、电压依赖L型钙通道抑制剂 nicardipine以及具有镇痛活性的电压依赖N型钙通道抑制剂ω-conotoxin中，只有ωconotoxin能够显著降低低剂量丙烯酰胺引发的内钙升高(表1).揭示丙烯酰胺针对不同类型离子通道作用靶点不同.

2.5 胞外钙、钠、钾离子浓度对丙烯酰胺作用的影响

分别改变胞外钙、钠、钾离子的浓度对丙烯酰胺作用的影响见表1.虽然丙烯酰胺导致的淋巴细胞胞内钙超载与钙缺乏相互对立，但胞外1 mmol/L钙离子比无钙介质明显加强了丙烯酰胺的作用；25 mmol/L的高钾环境也能够增强丙烯酰胺的影响.强心剂乌本苷(ouabain)能抑制细胞Na+-K+泵的活性，乌本苷孵育细胞并在无钠介质中测试，可以开启反向钠钙交换通道，促进外钙内流[6]，丙烯酰胺的加入抵消了乌本苷的作用.说明丙烯酰胺对淋巴细胞

[Ca]i的干扰与细胞内含量丰富的K、Na和Ca的协同作用相关联.

表1 不同缓冲体系中各种药物对淋巴细胞钙稳态的作用／nmol/L

图3 与对照(▼)相比较淋巴细胞对不同浓度丙烯酰胺作用的回复能力测试

2.6 抗氧化剂对丙烯酰胺作用的影响

淋巴细胞基因毒性的研究中证实抗氧化剂维生素E有助于修复丙烯酰胺引发的DNA损伤，抗氧化作用被认为是其潜在的抗癌的生物学效应中一个重要的机制.而食用富含维生素C的柑橘类水果可以有效降低丙烯酰胺在人尿中代谢物的排放.由表1可知维生素C和维生素E非常显著抑制了丙烯酰胺的干扰作用，说明日常饮食中的抗氧化剂有望修复丙烯酰胺造成的胞内钙水平异常.

3 结论

本试验表明丙烯酰胺对胞内钙离子浓度变化的扰动表现为低浓度增加高浓度抑制，该双相干扰可以被25μmol/L维生素C、维生素E显著抑制.虽然钙超载与钙缺乏相互对立，但均由同一刺激引起.该作用与细胞内钠离子和钾离子协同相关，最终导致胞内钙水平低于正常.淋巴细胞有一定能力恢复较低剂量丙烯酰胺(＜560μg/mL)对胞内钙水平的扰动.

[1]FAO/WHO Consultations on the Health Implications of Acrylamide in Food[EB/OL].(2002-06-25)[2007-07-12].Reportof a Joint FAO/WHO Consultation，Geneva，Switzerland.

[2]Bauma M，Fauthb E，Fritzena S，et al.Acrylamide and Glycidamide：Genotoxic Effects in V79-cells and Human Blood[J].Mutat Res，2005，580：61-69.

[3]Blasiak J，Gloc E，Wozniak K，etal.Genotoxicity of Acrylamide in Human Lymphocytes[J].Chem Bio Int，2004，149：137-149.

[4]LoPachin RM，Ross JF，Lehning E J，et al.Nerve Terminals as the Primary Site of Acrylamide Action：A Hypothesis[J].Neuro toxicol，2002，23(1)：43-59.

[5]Lewis R S.Calcium Signaling Mechanisms in T Lymphocytes[J].Annu Rev Immunol，2001，19：497-521.

[6]Wei Chunying，Yang Pin，Wang Haiyan.Quantitative Study on La3+Influx Mediated by Sodium-Calcium Exchanger in Human Lymphocytes[J].JScience in China，2002，32(4)：367-376.

A Study on the Effect of Acrylam ide on Intracellular Ca2+in Human Peripheral Lym phocytes by Fluorometric Method

WANG Hai-yan，WANG Xiao－li，LIU Hong，FENG feng
(School of Chemistry and Chemical Engineering，Shanxi Datong University，Datong Shanxi，037009)

The effect of acrylamide on intracellular free calcium concentration was studied by monitoring the fluorescence of human peripheral lymphocytes loaded with fura-2.

Acrylamide；Fura-2-AM；Lymphocytes；Ca2+signaling

O657.3

A

〔编辑 杨德兵〕

1674-0874(2010)01-0044-04

2009-10-13

山西省自然科学基金项目[2009011015-1]；山西大同大学校科研项目[2008K3]

王海雁(1972-)，女，山西大同人，博士，副教授，研究方向：光谱分析.