复合抑制剂防止粉红女士苹果汁褐变效果的研究

宋莲军，张 莹，唐贵芳

（河南农业大学食品科学技术学院，河南 郑州 450002)

粉红女士苹果是高酸苹果的代表品种，可滴定酸含量达到0.65%，是加工苹果汁的首选。粉红女士果皮气孔小，水分散失缓慢，长时间贮藏不皱皮，果面新鲜，烂果少，贮藏效果极佳。出汁率高，在采收期出汁率达80.4%，比富士高18.4%，贮藏50 d后，出汁率比澳洲青苹高8.7%。研究表明，粉红女士是一个综合品质优良、耐贮藏的鲜食、果汁加工兼用型苹果新品种[1－3]。然而，在苹果汁生产过程中，新鲜苹果经过破碎压榨后，很容易发生酶促褐变，这不仅影响产品的感官品质，而且其营养品质也随之发生劣变，严重影响了产品的销售和企业的经济效益，酶促褐变已经成为制约我国果汁产业发展的“瓶颈”。多酚氧化酶（polyphenol oxidase，简称PPO）参与苹果的酶促褐变早已得到证实，苹果的PPO pH值在4.0～8.0时有较高的稳定性，最适pH值在6.2～6.6之间，最适温度在20～30℃之间，其特性因苹果品种的不同而略有不同[4-7]。人们也一直在寻找合适的、能用于抑制苹果多酚氧化酶活性的防褐变剂，但仍然没有找到一种安全高效、成本低廉、使用简单且具有普遍应用性的抑制剂。植酸对果蔬汁也有护色效果，目前国内有关植酸在苹果汁生产中的应用研究较少[8]。H O zolu和A Bayindirli研究认为肉桂酸的防褐变作用仅次于L-半胱氨酸，但是不能达到长期防止酶促褐变的目的[9]。还有学者发现洋葱汁[10]、蛋白酶[11]和葡萄糖氧化酶-过氧化氢酶系统[12]可抑制酶促褐变，但由于口味的改变、成本高、添加量不确定等原因而没有得到广泛应用。

目前，国内对于粉红女士苹果加工成的鲜榨苹果汁的防褐变效果研究和苹果汁贮藏过程中防褐变的研究几乎没有报道。本试验以粉红女士苹果为试验材料，研究植酸、NaCl和EDTA-Na2对粉红女士PPO的效应，并在此基础上研究抑制剂及其组合在鲜榨苹果汁及苹果汁贮藏过程中防褐变的效果，以期为粉红女士的加工提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

粉红女士苹果，由陕西省果树研究所提供。贮存于4℃下备用。

1.2 仪器设备

Neofuge 23R台式冷冻离心机（香港力康发展有限公司）、WB-200IXA全自动测色色差计（北京康光仪器有限公司）；UV-2000紫外分光光度计（上海尤尼柯仪器有限公司）；R201C旋转蒸发仪（郑州长城科工贸有限公司）；HY-S回旋式振荡器（金坛市杰瑞尔电器有限公司）。

1.3 抑制率的测定

抑制率反映抑制剂对PPO的抑制程度，抑制率越高说明防褐变剂对PPO的抑制程度越大。

式中：A0——对照实验的吸光值；A——添加防褐变剂的吸光值

1.4 褐变率的测定

取3 mL苹果汁放入比色槽中（控制25℃），用全自动测色色差计通过反射法间隔一定时间测色[13]（以L值，a*值和b*值表示），其中L值越大则果汁越亮，反之越暗。A值越大则果汁越红，反之果汁越绿。B值越大则果汁越黄，反之越蓝。测定前仪器用标准白板进行校正，标准白板的色值为：L=0.03，a*=0.00，b*=1.29。

式中：L0——苹果加防褐变剂后制得的果汁的第一个L值；L1——苹果不加防褐变剂破碎后制的果汁放置t时间后的L值；L2——苹果加防褐变剂破碎后制的果汁放置t时间后的L值。

1.5 单一抑制剂对PPO活性的影响

取若干试管，按顺序加入0.1 mol/L 1 mL邻苯二酚及不同浓度的抑制剂，混匀，于30℃水浴中温育10 min后，分别加入酶液1 mL于30℃水浴反应1 min。立即加入三氯乙酸混匀，终止反应。取出，立即于分光光度计420 nm处[14]，以蒸馏水为参比，测OD值。根据不同浓度的抑制剂对PPO的抑制率制作曲线，考察防褐变剂的浓度对PPO活力的影响。

1.6 苹果汁的自然褐变

将去皮、去核的苹果果肉200 g切成小块，料液比按1∶1.25打浆l min，过滤、离心，放入瓶中（未封口）。间隔一定时间（15、30 min、1、2、4、8、12、24 h）测色值，其L值为L0。

1.7 单一抑制剂对鲜榨苹果汁的防褐变效果

配制一定浓度的抑制剂，然后按照1.6中的料液比制苹果汁，放置不同时间（同1.6）后测色值，并计算褐变抑制率。

1.8 复合抑制剂对鲜榨苹果汁的防褐变效果

将单一抑制剂按照不同浓度不同组合进行正交试验，然后按照1.6中的料液比制苹果汁，放置不同时间（同1.6）后测其色值，并计算褐变抑制率。

1.9 抑制剂对贮藏苹果汁的防褐变效果

在苹果汁中添加适量的苯甲酸钠，常温下放置，90 d后测定色值，计算其褐变抑制率。

2 结果与分析

2.1 植酸对PPO的效应

2.1.1 植酸对PPO活性的影响 不同浓度的植酸对PPO活性的影响如图1所示，随着植酸添加量的增加，PPO的活性逐渐降低。当草酸添加量为0.10%时，抑制率达88.59%；当添加量为0.20%时，抑制率达93.08%；当添加量为0.50%抑制率达97.82%。可见植酸可以较好的抑制PPO活力。选择0.20%作为植酸抑制PPO活性的浓度。植酸是很强的酸化剂，可以改变环境的pH而抑制酶活，它还是一种鳌合剂，通过螯合PPO的活性部位铜离子而抑制PPO的活力。

图1 植酸对PPO活性的影响

2.1.2 植酸对PPO的抑制效应 在测活体系中，固定底物（邻苯二酚）浓度为0.1 mol/L，加入不同浓度的植酸，改变加入的酶量，测定酶促反应的活力。以酶活力与加入的酶量作图，见图2。得到一组平行直线，随着植酸浓度的增大，直线的斜率基本不变，但横轴的截距随着植酸浓度的增大而增大。说明植酸对PPO的抑制作用属于不可逆过程，植酸是通过降低有效的酶量导致活力的下降，因此可以作为防褐变抑制剂。

2.2 NaCl对PPO的效应

2.2.1 NaCl对PPO活性的影响 不同浓度的NaCl对PPO活性的影响如图3所示，随NaCl添加量的增加，PPO的活性逐渐降低，当NaCl添加量在0.10%时，抑制率达63.35%，当添加量在0.20%，抑制率达66.75%，当添加量在0.50%抑制率达70.51%。可见NaCl可以抑制PPO活力。由于NaCl是咸味剂，添加量过大会影响苹果汁风味，故选择0.10%作为NaCl抑制PPO活性的浓度。

图3 NaCl对PPO活性的影响

2.2.2 NaCl对PPO的抑制效应 在测活体系中，固定底物（邻苯二酚）浓度为0.1 mol/L，加入不同浓度的NaCl，改变加入的酶量，测定酶促反应的活力。以加入的酶量为横坐标，以酶活力为纵坐标作图，见图4。得到一组通过原点的直线，随着NaCl浓度的增大，直线的斜率基本不变。说明NaCl对PPO的抑制作用属于不可逆过程，NaCl是通过降低有效的酶量导致活力的下降，可作为防褐变抑制剂。

图4 NaCl对PPO抑制机理的判断

2.3 EDTA-Na2对PPO的效应

2.3.1 EDTA-Na2对PPO活性的影响 不同浓度的EDTA-Na2对PPO活性影响如图5所示，随EDTA-Na2添加量的增加，PPO的活性逐渐降低，当EDTA-Na2添加量在0.10%时，抑制率达77.06%，当添加量在0.20%，抑制率达81.07%，当添加量在0.50%抑制率达83.01%。可见EDTA-Na2可以较好的抑制PPO活力。选择0.50%EDTA-Na2作抑制PPO活性的浓度。EDTA-Na2是很强的螯合剂，通过螯合PPO的活性部位铜离子而抑制PPO的活力。

图5 EDTA-Na2对PPO活性的影响

2.3.2 EDTA-Na2对PPO的抑制效应 在测活体系中，固定底物（邻苯二酚）浓度为0.1 mol/L，加入不同浓度的EDTA-Na2，改变加入的酶量，测定酶促反应的活力。以酶促反应活力与加入的酶量作图，得到一组平行直线，见图6。随着EDTA-Na2浓度的增大，直线的斜率基本不变，但横轴的截距随着EDTA-Na2浓度的增大而增大。说明EDTA-Na2对PPO的抑制作用属于不可逆过程，EDTA-Na2是通过降低有效的酶量导致活力的下降，可作为防褐变抑制剂。

图6 EDTA-Na2对PPO抑制机理的判断

2.3 苹果汁的自然褐变

衡量酶促褐变可用色差计测得的L值，L值越低则酶促褐变越严重。如果在一个时间段内值不断减小，表明酶促褐变一直在发生。由表1、图7可知，苹果破碎后24 h，苹果汁的L值由15 min时的64.02下降到41.30；同时a*值和b*值都升高了。这表明在自然条件下，苹果一经破碎，其细胞中的PPO则有机会与多酚底物接触，褐变反应将发生且有持续性，不能以此来衡量其它抑制剂的防褐变效果。

图7 鲜榨苹果汁的自然褐变

表1 苹果汁的自然褐变和添加亚硫酸氢钠后的防褐变情况

鉴于亚硫酸氢钠有极好的防止苹果汁酶促褐变的效果，故在制得的苹果汁中添加亚硫酸氢钠，测得苹果汁色值变化如表1、图8，L值在15 min～2 h时略有下降，之后就逐渐升高。加亚硫酸氢钠使果汁L值略有增大的原因，可能是亚硫酸氢钠还有漂白作用。因此，以后衡量其它抑制剂的防褐变效果时以此为对照。为了排除亚硫酸氢钠的漂白作用，都以加亚硫酸氢钠的L0值为对照来计算其它抑制剂的褐变抑制率。

图8 添加亚硫酸氢钠的鲜榨苹果汁的色值变化

2.4 单一抑制剂的防褐变效果

将鲜榨苹果汁放置24 h，植酸、NaCl和EDTANa2这3种抑制剂单独使用时，测得的防褐变效果有很大的区别，0.20%植酸的褐变抑制率为85.31%，0.10%NaCl的褐变抑制率为 52.78%，0.50%EDTA-Na2在鲜榨苹果汁中防褐变效果较差，这3种抑制剂的防褐变能力（褐变抑制率）依次为：0.20%植酸＞0.10%NaCl＞0.50%EDTA-Na2。

2.5 植酸、NaCl和EDTA-Na2组成的复合抑制剂防褐变正交实验

将植酸、NaCl和EDTA-Na2组合进行鲜榨苹果汁的防褐变效果正交实验。按L9（33）设计三因素三水平的试验，见表2。

表2 试验因素水平 （%）

正交试验的结果如表3所示，结果表明，在所有正交处理中，8号防褐变效果最好，褐变抑制率92.02%，其次是9号处理，褐变抑制率达91.52%。通过极差分析可知，复合抑制剂抑制率的主次因子分别是植酸、NaCl和EDTA-Na2。试验获得的最优组合为0.30%植酸、0.30%NaCl和0.25%EDTANa2，试验测得其褐变抑制率为92.87%。由方差分析表4可知，在显著性水平α=0.05时，植酸表现为差异显著性，NaCl和EDTA-Na2没有显著性；这表明植酸的影响对于试验结果较为重要，NaCl和EDTA-Na2的影响不明显。将制得的苹果汁贮藏90 d后，抑制褐变率达87.43%。

表3 复合抑制剂植酸正交试验结果

表4 方差分析表

3 结 论

本试验以粉红女士苹果为试验材料，研究了植酸、NaCl和EDTA-Na2制剂在鲜榨苹果汁及苹果汁贮藏过程中防褐变的效果，结果表明：植酸、NaCl、EDTA-Na2对PPO的抑制作用属于不可逆过程，是通过降低有效的酶量导致PPO活力的下降。这3种抑制剂单独使用时，防褐变能力（褐变抑制率）依次为：0.20%植酸＞0.10%NaCl＞0.50%EDTA-Na2。在此基础上，将这3种抑制剂进行复合，采用正交设计的方法确定了复合抑制剂最优组合为0.30%植酸、0.30%NaCl和0.25%EDTA-Na2，试验测得其褐变抑制率为92.87%，将制得的苹果汁贮藏90 d后，抑制褐变率达87.43%。

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