椰心叶甲幼虫被寄生后体壁主要物质含量的变化

孙蕊芬，龚声辉，姜迎娅，朱 麟

（海南师范大学 海南省热带动植物生态学重点实验室，海南 海口 571158）

椰心叶甲幼虫被寄生后体壁主要物质含量的变化

孙蕊芬，龚声辉，姜迎娅，朱 麟*

（海南师范大学 海南省热带动植物生态学重点实验室，海南 海口 571158）

椰心叶甲幼虫被寄生后体壁逐步硬化，几丁质、蛋白质、脂类等主要组分含量发生变化.石油醚溶解脂肪法、饱和KOH消化几丁质法、考马斯亮蓝结合法测定蛋白质，分析各组分含量变化.结果显示：被寄生幼虫表皮总脂肪相对含量7.59％，未寄生11.80％；被寄生幼虫表皮几丁质相对含量63.12％，未寄生58.10％；被寄生幼虫表皮蛋白质相对含量3.62％，未寄生13.26％，说明幼虫被寄生后体壁脂肪和蛋白质部分被寄生蜂利用.SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳分析被寄生幼虫体壁蛋白种类，比未寄生多出3条条带，缺失2条条带，说明幼虫被寄生后蛋白质种类有变化.

体壁；脂肪；几丁质；蛋白质

寄生蜂寄生后可引起寄主体内发生复杂的生理生化反应（梁光红，2007），椰心叶甲幼虫被寄生后体壁由乳白色变暗为棕黑色，逐步硬化.昆虫表皮的化学成分包括几丁质、蛋白质、脂类、多元酚及其氧化酶、色素.昆虫的体壁是体躯的最外层组织，由单一的细胞层及其分泌物所组成，由里向外可分为底膜、皮细胞层和表皮层.既能防止体内水分的蒸发，又能防止外来物质如病原体、杀虫剂等的侵袭，作为营养物质的储备库，在虫体饥饿和脱皮过程中，体壁内储存的营养物质可被消化和利用（彩万志，2004）.本实验测定椰心叶甲幼虫寄生后体壁各物质含量的变化.

1 材料和方法

1.1 总脂肪、几丁质提取及相对含量分析

寄生和未寄生的椰心叶甲幼虫均采自海口市郊区受害椰树，选取3～4龄椰心叶甲幼虫各200只.蒸馏水冲洗干净，未寄生幼虫将虫体沿腹中线纵向剖开，去除消化道、脂肪体和肌肉层后，将体壁用蒸馏水冲洗干净，60℃烘干至恒重，用电子天平（精确到0.000 1）称质量（w1），加入10倍质量的石油醚，超声波提取5 min后取出溶剂，再加入石油醚，反复提取5次后，加入20～30倍质量的石油醚振荡提取8 h.将脱脂后的表皮于60℃烘干至恒重，称质量（w2），w1与w2的差值（w1-w2）即为总脂肪含量.将脱脂后的干表皮用饱和KOH溶液甘油浴160℃消化30 min，碱解蛋白质后剩余透明几丁质残基，流水冲洗，再分别经体积分数95％和100％的乙醇脱水，称质量即得几丁质含量（w3），参考陈长琨的方法.寄生幼虫解剖虫体，剔除寄生蜂，方法同上.

1.2 体壁蛋白质提取和含量测定

寄生和未寄生椰心叶甲幼虫分别取200头剥离体壁，蒸馏水冲洗干净，滤纸吸干体表水分后称重，移入预冷的玻璃匀浆器中，加入1.2mL磷酸盐缓冲液（0.02mol/L，pH7.0）充分研磨，4℃，10 000 r/ min离心15 min，取上清-20℃保存备用.

考马斯亮蓝结合法测定蛋白质含量（陈钧辉，2007）.取7支10 mL离心管，分别加入0.1mg/mL牛血清白蛋白标准液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL，不足1.0 mL者以双蒸水补足至1.0 mL.每管中均加入考马斯亮蓝G-250溶液5 mL，混合均匀，放置2～3 min后，在595 nm波长下比色法测定吸光值.重复3次，以蛋白质浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线.

准确吸取上述蛋白质提取液，用双蒸水补足至1.0 mL，加入5 mL考马斯亮蓝G-250溶液，充分混匀后在595 nm波长下比色，记录吸光值，查阅标准曲线，计算寄生和未寄生幼虫蛋白质含量.

1.3 SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳

将样品与2×上样缓冲液（含4％SDS、10％巯基乙醇、20％甘油、0.000 1溴酚蓝）1∶1混匀，于沸水中煮3 min.采用垂直电泳仪，分离胶10％，浓缩胶4％电泳，当溴酚蓝指示线迁移至距下沿约1 cm时停止电泳.取下凝胶，考马斯亮蓝染色，冰乙酸和酒精脱色，凝胶成像清晰后拍照并分析.

2 结果与分析

2.1 总脂肪、几丁质、蛋白质相对含量分析

剥离200只椰心叶甲幼虫表皮60℃烘干恒重后，称量被寄生表皮总重平均0.212 3 g，未寄生表皮总重平均0.200 2 g，说明寄生前后表皮各物质总重量变化不大，经过测定分析，被寄生幼虫表皮总脂肪相对含量7.59％，未寄生11.80％；被寄生幼虫表皮几丁质相对含量63.12％，未寄生58.10％，说明幼虫被寄生后，一部分脂肪被利用，几丁质含量差异不大；被寄生幼虫表皮蛋白质相对含量3.62％，未寄生13.26％，相差4倍，说明幼虫被寄生后大部分蛋白质被利用（见表1）.

表1 椰心叶甲幼虫寄生后表皮总脂肪、几丁质、蛋白质相对含量Tab.1 Content of totalfats，chitin，totalprotein of parasitoid larvae's integument

2.2 SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳分析

外源入侵的异物浸入昆虫体后被虫体识别为非自身物质并诱导产生体液免疫和细胞免疫反应等（蒋红波，2006）.由于寄生后，幼虫体壁蛋白含量变化较大，随即进行蛋白条带分析，如图1所示，被寄生中条带数目增多，条带1，2，3，较明显，缺失4，5两条较明显，说明寄生后，体壁蛋白种类发生变化，参与免疫反应和自身保护调节.

3 讨论

寄主与寄生蜂之间的防御和反防御作用是二者在长期协同进化过程中形成的重要机制，寄主昆虫防御外源入侵除了采取一些体外物理防御措施外，主要采用细胞免疫反应和体液免疫反应（梁光红，2007）.寄生蜂对寄主生长发育、血淋巴蛋白质含量、血细胞含量、糖原含量、酚氧化酶活性及各类激素调解等产生影响（李季生，2006）.

椰甲截脉姬小蜂寄生椰心叶甲幼虫数天后寄主死亡.羽化出蜂前，寄主表皮逐渐坚硬，完好得保护寄生蜂成功羽化，在这一过程中，体壁各物质组分发生变化，其中蛋白质72.72％、脂类50.97％被利用，几丁质增加13.01％.蛋白质种类有变化，说明体壁也参与了免疫反应.

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责任编辑：黄 澜

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责任编辑：毕和平

Influence of Parasitoid Wasp on Integument CoMponents of Brontispa longissima（Gestro）Larvae

SUN Ruifen，GONG Shenghui，JIANG Yingya，ZHU Lin*
（College of Life sciences，Hainan Normal University，Hainan Provincial Key Laboratory of Tropical Plant and Animal Ecology，Haikou 571158，China）

The integument sclerosis occured after Brontispa longissima（Gestro）larvae were parasitized，the content of it's components changed.Though dissolving fats with mineral ether，digesting chitin wicth saturated KOH，detecting protein with coomassie brilliant blue，content of totalfats of parasitoid larvae is 7.59％，healthy larvae is 11.80％；Content of chitin of parasitoid larvae is 63.12％，healthy larvae is 58.10％；Content of totalprotein of parasitoid larvae is 3.62％，healthy larvae is 13.26％.The result indicated that the fats and protein were used by parasitoid wasps.SDSPAGE analysis of kinds of protein of parasitoid larvae's integument showed addition of 3 tapes and missing of 2 tapes，which indicated that the kinds of protein changed after parasitized.

integument；fats；chitin；protein

Q 966

A

1674-4942（2010）03-0306-02

2010-06-17

海南省教育厅椰心叶甲两种寄生蜂热激蛋白的表达研究资助项目（HxWsy2009-20）

*通讯作者